劉榮 欒淑瑩 方妍等

摘要[目的]優(yōu)化樟子松松塔多酚純化工藝，提高松多酚利用率。[方法]以吸附解析率為衡量指標，確定純化樟子松松塔多酚的最佳樹脂；以多酚回收率和純度為衡量指標，單因素試驗研究純化過程中各因素對純化效果的影響，并且利用響應(yīng)面優(yōu)化樟子松松塔多酚的純化工藝。[結(jié)果]樟子松松塔多酚的初步純化最適條件為上樣液濃度0.2 mg/ml，上樣液體積2.10 ml，樣液pH 7，徑高比1∶25.8，洗脫乙醇濃度57.75%。在此工藝參數(shù)下，樟子松松塔多酚的回收率可達68.78%。[結(jié)論]經(jīng)D4020大孔樹脂純化，樟子松松塔多酚純度由21.6%升至59.4%，說明D4020大孔樹脂適宜用于初步純化樟子松松塔多酚。

關(guān)鍵詞樟子松松塔；多酚；純化；大孔樹脂；響應(yīng)面

中圖分類號S791.253文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07869-04

基金項目國家自然科學(xué)基金項目（31170510）。

作者簡介劉榮（1971- ），女，黑龍江哈爾濱人，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事食品營養(yǎng)學(xué)與功能性食品研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事功能性食品開發(fā)研究。

收稿日期20140710多酚類化合物是廣泛分布于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物[1]，是一類具有苯環(huán)并結(jié)合有多個羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物總稱，其大量存在于植物中，是許多藥用植物的主要活性成分[2]。研究發(fā)現(xiàn)松科植物的體內(nèi)含有大量的多酚類化合物，具有一系列獨特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，這類化合物被統(tǒng)稱為松多酚。松多酚具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗動脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品、日用化學(xué)品以及保健品應(yīng)用等方面起到了一定的作用。目前多酚的提取方法包括有機溶劑浸提[3]、超聲波輔助提取[4]和酶法輔助提取[5]等。多酚純化的方法包括溶劑萃取和柱層析等，其中大孔樹脂柱層析因具有較好的吸附和解析效果被廣泛應(yīng)用。該試驗使用大孔吸附樹脂對樟子松松塔多酚進行純化，并優(yōu)化其工藝，以期提高樟子松松塔多酚的利用率，為減少能源消耗、充分開發(fā)利用植物多酚資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器樟子松松塔，產(chǎn)地是大興安嶺地區(qū)；沒食子酸、無水乙醇由天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠提供；濃鹽酸、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、福林酚由天津光復(fù)精細化工研究所提供；大孔樹脂ADS7、大孔樹脂 ADS17、大孔樹脂 NKA2、大孔樹脂 D4020、大孔樹脂 AB8、大孔樹脂 D3520由天津海光試劑公司提供。

（FW135）高速萬能粉碎機、（DK98IIA）電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；（RE52E）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；（DHG9240型）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；（Φ1 cm×500 mm）層析柱（天津海光試劑公司）。

1.2研究方法

1.2.1松塔多酚粗提物的制備。將干燥后的樟子松松塔剪成碎片，在粉碎機中粉碎成粉末，過40目篩，得到樟子松松塔多酚粉末。按照乙醇濃度50%，料液比1∶25（g/ml），提取時間4 h，提取溫度50 ℃的條件進行水浴提取，提取后抽濾[6]。上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容。按照FolinCiocalteu法[7]測定提取液中多酚含量為19.35 mg/ml，純度為21.6%。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理。采用6種不同極性的大孔樹脂進行試驗，將各種型號大孔樹脂置于95%的乙醇中浸泡12 h，充分溶脹后用蒸餾水洗滌，沖洗至無白色渾濁物出現(xiàn)，用5%鹽酸浸泡4 h，蒸餾水充分洗滌至中性，再用5%氫氧化鈉溶液浸泡4 h，蒸餾水充分洗滌至中性后備用。每次上樣洗脫完畢后，先用5%HCl 洗至無色，用蒸餾水洗至pH為中性，再用5%NaOH 洗至無色，最后用蒸餾水洗至pH為中性，方可重復(fù)利用。

1.2.3大孔樹脂對樟子松松塔多酚吸附劑解吸附性能研究。將預(yù)處理后的各種型號大孔樹脂各10.0 g，置于100 ml錐形瓶中。向各錐形瓶中分別加入40 ml濃度為2 mg/ml的樟子松松塔多酚樣品液。將錐形瓶放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附6 h，在振蕩開始后的1、2、3、4、5、6 h時，分別量取1 ml多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法測定多酚含量，按照式Ⅰ計算吸附率，繪制吸附曲線。隨后過濾除去樟子松松塔多酚樣品溶液，將各種型號樹脂用蒸餾水洗凈并置于100 ml錐形瓶中，分別加入40 ml 50 %乙醇置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩解析6 h，在解析進行1、2、3、4、5、6 h時，分別量取1 ml溶液，解析后的樟子松松塔多酚解析液，采用FolinCiocalteu法顯色后測定吸光值，并計算多酚含量，繪制解析曲線，按照式Ⅱ計算解析率。比較6種大孔樹脂對樟子松松塔多酚的吸附率與解析率的影響，確定純化時可使用的最佳樹脂。

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1.2.4靜態(tài)吸附下樣品濃度和pH的適宜工藝條件研究。準確稱取6份10.0 g預(yù)處理后的大孔樹脂于100 ml錐形瓶中，加入濃度為1.0 mg/ml的樟子松松塔多酚樣品液40 ml，并分別調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5、6、7，調(diào)節(jié)pH后加入蒸餾水補齊體積至50 ml。放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附一定時間，量取1 ml樟子松松塔多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法顯色后測定其吸光值，研究pH對大孔樹脂吸附樟子松松塔多酚效果的影響。

準確稱取6份10.0 g預(yù)處理后的大孔樹脂于100 ml錐形瓶中，加入濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/ml的樟子松松塔多酚提取物樣品液50 ml。放置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩吸附一定時間，量取1 ml樟子松松塔多酚樣品液，采用FolinCiocalteu法顯色后測定其吸光值，研究樣品液濃度對大孔樹脂吸附多酚效果的影響。

1.2.5動態(tài)吸附下純化工藝條件研究。大孔樹脂濕法裝柱，向玻璃層析柱中滴加濃度為25 mg/ml的粗提液5 ml，吸附2 h，先用2倍柱體積的蒸餾水清洗，再用50%乙醇溶液洗脫，收集流出液，每5 ml收集1次，測定其中樟子松松塔多酚的濃度（mg/ml），繪制洗脫曲線。收集濃度最大的30 ml，計算多酚回收率（式Ⅲ），并于40 ℃烘干后復(fù)溶，測定其多酚含量，計算純度（式Ⅳ）。

樟子松松塔多酚提取響應(yīng)面試驗因素水平

水平因素A洗脫劑乙醇濃度∥%B上樣液體積∥mlC徑高比-1401.51∶200502.01∶251602.51∶30

利用Design expert 6.0.5軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，以多酚回收率為響應(yīng)值，確定最佳的純化條件，并根據(jù)結(jié)果進行驗證試驗[8]。

2結(jié)果與分析

2.1大孔樹脂的篩選所用的6種樹脂的物理特性見。這6種大孔樹脂對于樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的結(jié)果見。由可以看出，NKA2、ADS7、D3520這3種樹脂對多酚的吸附率可高達71.55%、71.65%、72.34%，但是其解析率僅為38.24%、34.94%、35.60%，而D4020樹脂吸附率和解析率都高于其他5種樹脂，所以D4020樹脂是純化樟子松松塔多酚的理想樹脂。

6種大孔樹脂理化性質(zhì)

樹脂種類比表面積∥m2/g平均孔徑∥nm極/非極性NKA-2160～20014.5～15.5極性ADS-790～150200極性ADS-1790～15025～30中等極性AB-8480～52013～14弱極性D3520480～52085～90非極性D4020540～580100～105非極性

6種大孔樹脂對樟子松松塔多酚的吸附率和解析率的影響2.2D4020大孔樹脂靜態(tài)吸附條件的研究

2.2.1上樣液濃度對樹脂吸附率、解析率的影響。樟子松松塔多酚粗提物上樣液濃度對D4020樹脂吸附率、解析率的影響如所示。隨著粗提物濃度的增加，樹脂吸附率下降，其原因可能是隨樣品濃度增大，樹脂間的孔隙被填滿，達到飽和狀態(tài)。樹脂解析率在粗提物濃度為0.2 mg/ml時達到最大值，之后呈下降趨勢。綜合考慮，采用上樣液濃度0.2 mg/ml進行后續(xù)試驗。

上樣液濃度對D4020樹脂吸附率和解析率的影響2.2.2上樣液pH對樹脂吸附率、解析率的影響。如所示，D4020樹脂對樟子松松塔多酚的吸附率與解析率在pH為7時達到最大值，而最初的樟子松松塔多酚提取液pH就在7左右，所以試驗最適的上樣液pH為7，后續(xù)試驗無需調(diào)節(jié)上樣液pH。

上樣液pH對D4020樹脂吸附率和解析率的影響2.3D4020大孔樹脂動態(tài)吸附條件的研究

2.3.1洗脫曲線的繪制。選取2 ml濃度為2 mg/ml的提取液充分吸附后用50%乙醇洗脫，每5 ml收集1管，測定其中多酚的濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線。由可以看出，從第2管開始，洗脫液中多酚含量顯著增加，當(dāng)洗脫至第4管時洗脫液中多酚含量達到最大值，從第6管之后隨著洗脫體積的增加，多酚含量逐漸下降，所以該試驗收集2～6管的30 ml樟子松松塔多酚溶液進行后續(xù)試驗。

樟子松松塔多酚動態(tài)洗脫曲線2.3.2上樣液體積對松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨著上樣液體積的增加，樟子松松塔多酚純度呈先上升后下降的趨勢，在上樣液體積為3 ml時達到最高。呈現(xiàn)這一趨勢的原因可能是隨著上樣液體積的增加，大孔樹脂對多酚的吸附量增加，但是上樣液體積過大，與松多酚競爭吸附的雜質(zhì)也相應(yīng)增多，導(dǎo)致松多酚在樹脂內(nèi)部的擴散能力降低[9]。隨著上樣液體積的增加，松多酚回收率也呈先上升后緩慢下降的趨勢，在上樣液體積為2 ml時達到最大值。由于純度變化程度比回收率變化程度小，綜合考慮上樣液體積確定為2 ml。

上樣液體積對松塔多酚回收率及純度的影響2.3.3徑高比對松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨著徑高比的增加，松塔多酚的純度變化不明顯。隨著徑高比的增加，松塔多酚的回收率先呈上升趨勢，在徑高比為1∶25時達到最高，之后隨徑高比增加呈下降趨勢，在徑高比為1∶35時又呈上升趨勢，但是徑高比過大，會導(dǎo)致松塔多酚在大孔樹脂內(nèi)的擴散路徑增加，造成大孔樹脂的浪費，同時增加了松多酚的損失。綜合考慮其影響，確定徑高比為1∶25。

42卷23期劉 榮等大孔樹脂對樟子松松塔多酚的純化工藝研究徑高比對松塔多酚的回收率及純度的影響2.3.4洗脫劑乙醇濃度對松塔多酚回收率、純度的影響。由可知，隨洗脫劑乙醇濃度的增加，松塔多酚純度先呈緩慢上升趨勢，在洗脫劑乙醇濃度為50%時達到最高，之后隨洗脫劑乙醇濃度增加呈下降趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，乙醇濃度增加，松塔多酚的溶解性也不斷增加，因而純度提高，但由于樟子松松塔多酚既含醇溶性成分，又含有水溶性成分，過高的乙醇濃度導(dǎo)致水溶性多酚溶解性降低，同時高濃度的醇溶液會導(dǎo)致醇溶性雜質(zhì)被溶解出來，因此純度會有所下降。隨著洗脫劑乙醇濃度的增加，松塔多酚回收率也呈先上升再下降的趨勢。綜合考慮對松塔多酚純度和回收率的影響，洗脫劑乙醇濃度確定為50%。

采用響應(yīng)面法軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，其結(jié)果見。模型誤差P=0.008 4，差異顯著；失擬項P=0.139 8>0.05，差異不顯著，說明了方程對試驗擬合的情況好，試驗誤差小；變異系數(shù)值為2.02，接近于1，說明試驗可靠性高；模型的校正決定系數(shù) R2adj=0.875 4，說明該模型能解釋87.54%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約12.46%不能用此模型來解釋。

洗脫液乙醇濃度的一次項、徑高比一次項對純度的影響顯著；徑高比的二次項的影響為極顯著；洗脫液濃度的二次項、上樣液體積的二次項、上樣液體積和徑高比的交互項，洗脫液濃度和上樣液體積的交互項，洗脫液濃度和徑高比的交互項的影響不顯著。通過F值還能看出，試驗中各因素對樟子松松塔多酚回收率的影響大小順序為徑高比、洗脫液濃度、上樣液體積。

洗脫液濃度、徑高比對樟子松松塔多酚回收率影響的響應(yīng)面從樟子松松塔多酚回收率與徑高比、洗脫液濃度曲面圖可以看出，最優(yōu)點趨近于徑高比1∶26、洗脫液乙醇濃度60%時，回收率在這2點附近達到最大值。從樟子松松塔多酚與上樣液體積、徑高比曲面圖可以看出，最優(yōu)點趨近于上樣液體積2.10 ml和徑高比1∶25.5，回收率在這2點附近達到最大值。從樟子松松塔多酚與洗脫液濃度、上樣液體積曲面圖（0）可以看出，最優(yōu)點趨近于洗脫液濃度58%，上樣液體積2.10 ml時，回收率在這2點附近達到最大值。經(jīng)分析優(yōu)化后，最終確定松多酚初級純化最優(yōu)提取條件為洗脫劑乙醇濃度57.75%、上樣液濃度0.2 mg/ml、上樣液體積2.10 ml、徑高比1∶25.8，經(jīng)優(yōu)化后樟子松松塔多酚回收率可達68.78%，純度可達59.4%。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化驗證試驗對試驗進行放大處理，采用柱體積為370 ml，上樣液體積15.5 ml，洗脫液濃度57.70%，上樣液濃度0.2 mg/ml，徑高比1∶25.8這些提取條件，選取濃度最大的6段樣液進行混合，測其吸光值，計算得回收率為68.59%。