程欲+++劉樹(shù)滔++饒平凡

摘要：尖吻蝮蛇類凝血酶直接裂解纖維蛋白原且不激活凝血因子表現(xiàn)出良好抗凝效應(yīng)，是重要的血栓類藥物。大腸桿菌中高效表達(dá)重組尖吻蝮蛇類凝血酶，通過(guò)陰離子層析（DEAE650M，0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫）和親和層析（鎳柱，0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫），獲得較純樣品。利用腸激酶酶切、纖維蛋白凝結(jié)活性、免疫印跡方式鑒定純化樣品為活性目的蛋白。此結(jié)果為商品化生產(chǎn)、應(yīng)用類凝血酶提供思路及方向。

關(guān)鍵詞：類凝血酶 純化 鑒定

中圖分類號(hào)：G64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）07（b）-0000-00

類凝血酶（thrombin-like enzyme）是一種絲氨酸蛋白酶[1-2]，作用于纖維蛋白原，使其產(chǎn)生側(cè)鏈不交聯(lián)的片段。該片段易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬或正常纖溶作用清除[3-4]，而不激活凝血因子，具有重要醫(yī)藥價(jià)值。受限于天然活體來(lái)源及復(fù)雜的復(fù)雜純化條件，蛇毒類凝血酶在血栓類藥物研發(fā)中難以突破[5]。本文利用工程菌構(gòu)建、表達(dá)出尖吻蝮蛇類凝血酶，研究其純化條件，鑒定其純化效果，以期大量、高效獲得活性蛋白，應(yīng)用于商品化生產(chǎn)、利用。

1 材料與方法

1.1菌株

穩(wěn)定表達(dá)尖吻蝮蛇類凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）由福州大學(xué)生物工程研究所保存。

1.2試劑與儀器

離子交換樹(shù)脂填料DEAE650M、親和層析組氨酸填料（His鎳柱）保藏于福州大學(xué)生物工程研究所；重組腸激酶（EK酶）購(gòu)于invitrogen公司產(chǎn)品；牛纖維蛋白原購(gòu)于Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

蛋白純化系統(tǒng)及恒壓恒流電泳儀購(gòu)于東方特力科貿(mào)中心；Mini PROTEIN II電泳槽購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3重組類凝血酶表達(dá)

穩(wěn)定表達(dá)尖吻蝮蛇類凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）于LB+培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基添加有氨芐青霉素），30℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol·L-1條件下培養(yǎng)3h[6]，獲取重組蛋白.。

1.4重組類凝血酶純化

1.4.1陰離子層析——DEAE650M

綜合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將重組菌破碎液通過(guò)陰離子層析柱（DEAE650M），通過(guò)添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（PBS緩沖液）階梯洗脫，收集峰樣用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280，并記錄數(shù)據(jù)、繪制曲線圖譜，以此獲得初步純化樣品，-20℃保藏備用. 。

全過(guò)程中使用緩沖液如表1所示。

試劑 組成

平衡緩沖液 20mM PBS（pH7.5）

洗脫緩沖液 20mM PBS（含不同濃度NaCl）

1.4.2親和層析——鎳柱

利用重組融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽（六個(gè)His殘基序列）能夠與二價(jià)金屬離子（如鎳、鋅等）螯合，達(dá)到特異性吸附、分離功效。將陰離子層析收集含有目的蛋白樣品，通過(guò)鎳柱親和層析再次純化，全過(guò)程使用緩沖液如表2所示。樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280，記錄數(shù)據(jù)并繪制曲線圖譜，收集純化樣品，-20℃保藏備用。

試劑 組成

鎳柱活化緩沖液 0.1M NiSO4緩沖液

平衡緩沖液 20mM PBS（pH8.0）

洗脫緩沖液 20mM PBS（含不同濃度咪唑、0.5M NaCl）

1.5重組類凝血酶鑒定

1.5.1 SDS-PAGE

采用不連續(xù)凝膠檢測(cè)，分離膠濃度12.5%，蛋白條帶用考馬斯亮藍(lán)染色[7]。

1.5.2纖維蛋白凝結(jié)活性

1mg· mL-1的純化產(chǎn)物與9mg·mL-1的牛纖維蛋白原（均溶解于Tris-HCl緩沖溶液，pH7.0，）37℃孵育1h，觀察凝結(jié)現(xiàn)象。同時(shí)以純水、牛纖維蛋白代替目標(biāo)蛋白作對(duì)照組[8-9]。

1.5.3腸激酶酶切

pET32a載體在融合硫還原蛋白與自身蛋白間存在腸激酶酶切位點(diǎn)。取純化樣品100μl加入1U腸激酶，輕混后37℃溫浴2h，利用腸激酶酶切特性，將融合蛋白酶分成兩個(gè)片段，而后通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)片段分子量測(cè)定，初步驗(yàn)證重組融合蛋白。實(shí)驗(yàn)以純水代替腸激酶作為空白對(duì)照組。

1.5.4免疫印跡

純化樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后割下相應(yīng)凝膠，利用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（電泳-割膠-轉(zhuǎn)膜）；而后轉(zhuǎn)移至封閉液中，室溫下振搖1h（免疫：封閉）；取出、吸凈殘液，將蛋白面浸沒(méi)于一抗液，室溫孵育1h，而后用TBST室溫下振搖兩次，每次10min，再用TBS室溫下振搖10min（免疫：一抗反應(yīng)）；取出、吸凈殘液，用二抗液室溫孵育1-2h，而后再用TBST室溫下振搖兩次，每次10min，TBS室溫下振搖10min，取出進(jìn)行顯色（免疫：二抗反應(yīng)）.）。

2 結(jié)論

2.1重組類凝血酶純化

2.1.1陰離子層析——DEAE650M

誘導(dǎo)表達(dá)后菌體經(jīng)超聲波破碎、高速離心，結(jié)果顯示目的蛋白大部分存在于上清液（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證），為可溶性蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)間理化性質(zhì)差異，經(jīng)不同鹽溶液階梯洗脫，檢測(cè)OD280，收集峰樣，繪制曲線，如圖1所示。為判定收集樣品中蛋白分布，經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，如圖2所示。

通過(guò)ExPASy-Compute pI/Mw計(jì)算可知，尖吻蝮蛇類凝血酶理論分子質(zhì)量為44.3kDa，對(duì)比電泳圖譜可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫條件下得到主要目的蛋白樣品（D2），收集此峰樣用于再次純化 。

2.1.2親和層析——鎳柱

粗純化類凝血酶樣品（D2）通過(guò)鎳柱親和層析，在不同咪唑濃度條件下階梯洗脫，收集樣品，檢測(cè)OD280繪制曲線，如圖3所示。獲得峰樣，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，如圖4所示。 電泳圖譜中N2樣品（0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫）在目的蛋白理論分子量處存在較為單一條帶，推斷經(jīng)過(guò)兩步操作，可獲得較純尖吻蝮蛇類凝血酶樣品。

2.2重組類凝血酶驗(yàn)證

2.2.1腸激酶酶切

表達(dá)蛋白樣品與腸激酶在37℃條件下反應(yīng)1h，利用SDS-PAGE檢測(cè)，如圖5所示。融合蛋白被剪切為分子量18kDa和26kDa兩部分，且目的蛋白處存在明顯因剪切而減少的痕跡，此現(xiàn)象與預(yù)期構(gòu)建結(jié)果相契合。一定程度上表明，表達(dá)蛋白即尖吻蝮蛇類凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）。

2.2.2纖維蛋白凝結(jié)活性

利用試管法[8-9]處理樣品，如圖6所示 。陰性實(shí)驗(yàn)組（空白對(duì)照組，超純水）樣品呈現(xiàn)澄清透明狀液體，陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組（牛凝血酶）呈現(xiàn)明顯渾濁膠狀，樣品組（純化目標(biāo)蛋白）呈現(xiàn)與陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組相似渾濁膠狀。

結(jié)果表明，重組蛋白pET32a-acutobin對(duì)牛纖維蛋白原具有特異酶活性，能使其出現(xiàn)白色渾濁狀態(tài)，但無(wú)法真正形成凝固。其凝結(jié)效果與天然類凝血酶活性間仍存在差距。

2.2.3免疫印跡（Western blotting）

經(jīng)過(guò)兩步純化后樣品，借助His標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。N2樣品條帶均是帶有His標(biāo)簽的相關(guān)蛋白質(zhì)，推斷理論分子量處條帶為類凝血酶pET32a-acutobin，其余條帶可能為多個(gè)目的蛋白集合體（上端）和目的蛋白分離體（下端）.。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用工程菌重組表達(dá)類凝血酶，經(jīng)純化應(yīng)用于實(shí)際生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表達(dá)，以較低的環(huán)境代價(jià)為前提可獲得大量用于醫(yī)療的血栓類藥物，解決了直接由活體動(dòng)物提取的道德問(wèn)題、提取量少、純化不易等瓶頸問(wèn)題。通過(guò)簡(jiǎn)單的兩步純化，能夠很好的排除雜質(zhì)干擾，得到較為單一且具有活性的目的蛋白，既優(yōu)化工藝又節(jié)省成本。然而，酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產(chǎn)品仍存在差異。然而，酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產(chǎn)品仍存在差異。

重組類凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）要正式推向市場(chǎng)，現(xiàn)階段仍需解決酶活力提升[10]、保存問(wèn)題，熱源性、致敏性物質(zhì)去除問(wèn)題等 。同時(shí)，相較于原核體系大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)的類凝血酶，可利用重組手段構(gòu)建胞外分泌真核體系目的蛋白從純化及適用性角度提升其整體價(jià)值。

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