谷政偉+胡鐵+黎繼烈+李振海

摘要：為探討纈草（Valeriana officinalis L.）黃酮純化工藝，以樹脂對黃酮的吸附率和解吸率為評價指標，通過靜態(tài)吸附-解吸試驗對6種樹脂進行優(yōu)選，在此基礎(chǔ)上開展動態(tài)吸附-解吸試驗，對上樣與洗脫條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，采用聚酰胺柱層析純化纈草黃酮，在上樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、上樣量20.0 mL、上樣液pH 5.5的條件下，用70.0%乙醇洗脫，洗脫流速2.0 mL/min、洗脫劑70.0 mL純化3次，洗脫液經(jīng)干燥、檢測，發(fā)現(xiàn)黃酮純度由粗品17.58%提高到79.17%。該工藝簡單、安全、環(huán)保，可得到較高純度的黃酮，適合純化纈草黃酮。

關(guān)鍵詞：纈草（Valeriana officinalis L.）；黃酮；純化

中圖分類號：S567.23+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5336-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.042

Abstract：In order to investigate the purification process of flavonoids from Valeriana officinalis L.，the optimum resin was chosen from 6 kinds of resins by the static absorption-desorption tests and the adsorption and desorption rate of resins to flavonoids were used as index. Based on the above results，the sample and elution conditions were optimized by the dynamic absorption-desorption experiments. Flavonoids from Valeriana officinalis L. were purified by polyamide column chromatography and the optimum sample conditions were concentration 2.0 mg/mL，velocity 1.5 mL/min，amount 20.0 mL and pH value 5.5，the optimal elution conditions were ethanol concentration 70.0%，velocity 2.0 mL/min and amount 70.0 mL. Under the above conditions，the purity of flavonoids was from 17.58% up to 79.17% by three times purification. The above approach is appropriate to purify flavonoids from Valeriana officinalis L. for it is safe，friendly to environment，easy to operate and can gain flavonoids safely with high purity.

Key words：Valeriana officinalis L.； flavonoids； purification

纈草（Valeriana officinalis L.）系敗醬科纈草屬植物，有著悠久的藥用歷史[1]。研究表明，纈草含有黃酮、揮發(fā)油、生物堿和木脂素等[2]。黃酮廣泛存在于植物中，具有多種活性，例如抗氧化、抑菌、抗腫瘤和護肝等，且無明顯副作用，可應用于制藥和食品加工等領(lǐng)域[3，4]。纈草黃酮粗提液中有大量的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖類、脂肪及色素等，需純化才能被更好地利用，如探討生物活性、鑒定結(jié)構(gòu)和研制制劑等。肖婷等[5]和郜紅利等[6]采用大孔樹脂HPD-600柱層析純化蜘蛛香黃酮，譚斌[7]開展聚酰胺柱層析純化寬葉纈草黃酮，目前尚未發(fā)現(xiàn)提純纈草黃酮的報道，因此本研究利用柱層析對纈草黃酮進行純化，結(jié)合靜態(tài)與動態(tài)吸附-解吸試驗，對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，以期獲得較高純度的黃酮，為纈草及黃酮的更深層次開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 纈草葉采自湖南省林業(yè)科學院試驗基地大棚，經(jīng)中南林業(yè)科技大學蔣麗娟教授鑒定為纈草屬植物纈草的葉。

1.1.2 試劑 D-101、AB-8、HPD-450A、HPD-600、NKA-9大孔樹脂，天津南開大學樹脂有限公司； 80-100目聚酰胺樹脂，上?？瑯由锛夹g(shù)有限公司；蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸和冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 PyNN130745型微波萃取儀（美國培安公司）；V-5100型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；層析柱（上海滬西分析儀器廠有限公司）；DHL-B型電腦定時恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ZWY-2102C型立式全溫振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；高速臺式冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 纈草葉預處理 纈草葉預處理按文獻[8]中方法操作。

1.2.2 樣品溶液的制備 在纖維素酶濃度1.9 U/mL、液料比21.5∶1（mL∶g，下同）、乙醇體積分數(shù)48.0%、提取溫度45.0 ℃條件下，超聲波輔助提取61.0 min，提取完畢收集提取液，抽濾去殘渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至較小體積，冷凍干燥后加入適量蒸餾水并充分攪拌，超聲波處理15 min，使其充分溶解，備用。

1.2.3 蘆丁標準曲線的制作 標準曲線的制作參考文獻[8]。

1.2.4 黃酮純度的檢測 按照文獻[8]中方法檢測干燥物中黃酮質(zhì)量，按下式計算黃酮純度。

黃酮純度=干燥物中黃酮質(zhì)量/干燥物質(zhì)量×100%

1.2.5 樹脂預處理 大孔樹脂預處理：95.0%乙醇浸泡24.0 h并不斷攪拌→按濕法裝柱→95.0%乙醇洗至流出液與蒸餾水混合（1∶5）不出現(xiàn)白色混濁→蒸餾水洗至無醇味→2%NaOH浸泡2.0～4.0 h→蒸餾水洗至中性→5.0%HCl浸泡2.0～4.0 h→蒸餾水洗至中性，過濾后備用。聚酰胺樹脂預處理：95.0%乙醇浸泡24.0 h并不斷攪拌→按濕法裝柱→95.0%乙醇洗至流出液加適量蒸餾水（1∶5）不出現(xiàn)白色混濁→蒸餾水洗至無醇味→2.0%NaOH浸泡2.0～4.0 h→蒸餾水洗至中性→10%醋酸浸泡2.0～4.0 h→蒸餾水洗至中性，過濾后備用。

1.2.6 樹脂再生 大孔樹脂再生：95.0%乙醇洗至流出液無色，之后按預處理方法用NaOH與鹽酸處理即可。聚酰胺樹脂再生：95.0%乙醇洗至流出液無色，之后按預處理方法用NaOH與醋酸處理即可。

1.2.7 靜態(tài)吸附-解吸試驗 取預處理好的樹脂2.5 g，裝入三角瓶，加入制備好的樣品溶液25.0 mL（黃酮濃度0.5 mg/mL），密封后放入搖床（轉(zhuǎn)速150 r/min），在30.0 ℃條件下振蕩12.0 h，過濾，按“1.2.4”中方法檢測濾液中黃酮濃度，按文獻[9]中方法計算吸附量和吸附率。將上述吸附黃酮后的樹脂用適量蒸餾水洗滌后裝入三角瓶，加入60.0 mL 70.0%乙醇，密封后放入搖床（轉(zhuǎn)速150 r/min），30.0 ℃振蕩12.0 h，過濾，檢測濾液的黃酮濃度，按文獻[9]中方法計算解吸率。

1.2.8 動態(tài)吸附-解吸試驗 取樹脂8.0 g→濕法裝柱→樣品溶液上柱→蒸餾水洗脫除雜→乙醇洗脫→收集洗脫液→減壓濃縮→冷凍干燥。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附試驗

2.1.1 樹脂篩選 按“1.2.7”中方法考察樹脂對纈草黃酮的靜態(tài)吸附量、吸附率與解吸率，結(jié)果見表1。由表1可知，聚酰胺樹脂對纈草黃酮的吸附量、吸附率和解吸率均高于其他樹脂，因此，以聚酰胺樹脂為纈草黃酮富集純化的載體。

2.1.2 溫度對聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附性能的影響 其他吸附條件同“1.2.7”，設(shè)置溫度分別為30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0 ℃，考察溫度對聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附性能的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著溫度升高，吸附率逐漸降低，這是因為聚酰胺樹脂吸附黃酮是一個自發(fā)地放熱過程，溫度升高不利于吸附。

2.1.3 聚酰胺樹脂的靜態(tài)吸附動力學特性檢測 其他吸附條件同“1.2.7”，設(shè)置振蕩時間分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h，考察聚酰胺樹脂的靜態(tài)動力學吸附曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，聚酰胺樹脂對纈草黃酮的吸附為快速平衡型，即在起始階段吸附率增加較快，在4.0 h接近平衡，這是因為在吸附初始階段，樹脂表面與黃酮接觸充分，有利于樹脂對黃酮的吸附，隨著時間延長，孔容的限制導致樹脂對黃酮的吸附接近飽和，吸附率變化不明顯。

2.2 動態(tài)吸附試驗

2.2.1 上樣液濃度對吸附率的影響 在上樣量20.0 mL、上樣流速2.0 mL/min條件下，設(shè)置上樣液濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL，按“1.2.8”中方法進行動態(tài)吸附試驗，考察上樣液濃度對吸附率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著上樣液濃度的增加，吸附率逐漸減小，這是因為上樣液黃酮濃度增大使黃酮分子在樹脂內(nèi)部的擴散能力降低，且濃度增加后，與黃酮競爭樹脂吸附位點的雜質(zhì)將增多，導致吸附率下降，因此確定2.0 mg/mL為最適上樣液濃度。

2.2.2 上樣量對吸附率的影響 在上樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速2.0 mL/min條件下，分別上樣20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 mL，考察不同上樣量對吸附率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著上樣量的增加，吸附率逐漸降低，這是因為上樣量越多，樹脂對黃酮的吸附越接近飽和，為提高上樣液利用率，選擇20.0 mL為最佳上樣量。

2.2.3 上樣流速對吸附率的影響 在上樣液濃度2.0 mg/mL、上樣量20.0 mL條件下，分別以流速1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/mim上樣，考察不同上樣流速對吸附率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著上樣流速增加，吸附率逐漸降低，這可能是因為上樣流速增大使上樣液與樹脂的接觸時間減少，黃酮分子未被完全吸附即流出樹脂柱，因此確定1.5 mL/min為最適上樣流速。

2.2.4 上樣液pH對吸附率的影響 在上樣液濃度2.0 mg/mL、上樣量20.0 mL、上樣流速1.5 mL/min條件下，設(shè)置上樣液pH分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，考察不同上樣液pH對吸附率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當pH在3.5～5.5，pH越大吸附率越高，pH超過5.5時，吸附率隨著上樣液pH的增大而降低，這是因為黃酮在強酸性條件下易形成“佯鹽”；在偏堿性條件下易失去酚羥基H+，形成離子結(jié)構(gòu)，影響樹脂對黃酮的吸附，因此確定最適上樣液pH為5.5（上樣液本身pH 4.5）。

2.2.5 水洗脫用量的考察 聚酰胺樹脂吸附黃酮后，用蒸餾水洗脫可除去多糖等雜質(zhì)，也會對吸附的黃酮造成損失，因此以洗脫液中黃酮含量和多糖吸光度為主要指標優(yōu)選水洗脫用量。依照已優(yōu)化的條件上樣，按每管10.0 mL收集水洗脫液，按“1.2.4”中方法檢測每管洗脫液的黃酮濃度，采用苯酚-硫酸法于波長490.0 nm下檢測多糖吸光度[10]，結(jié)果見表2。水洗脫除雜對黃酮造成的損失較小，第4管的多糖吸光度已接近零，因此確定最適水洗脫用量為40.0 mL。

2.3 動態(tài)解吸試驗

2.3.1 洗脫劑體積分數(shù)對解吸率的影響 按已優(yōu)化的條件上樣和水洗脫除雜，在洗脫流速2.0 mL/min條件下，分別用60.0 mL的40.0%、50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%乙醇洗脫，按“1.2.8”中方法進行動態(tài)吸附-解吸試驗，考察不同洗脫劑體積分數(shù)對解吸率的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，當洗脫劑體積分數(shù)在40.0%～70.0%，解吸率隨著洗脫劑體積分數(shù)的增大而升高，當洗脫劑體積分數(shù)大于70.0%后，解吸率逐漸減小，因此確定70.0%為最適洗脫劑體積分數(shù)。

2.3.2 洗脫流速對解吸率的影響 在洗脫劑體積分數(shù)70.0%、洗脫劑量60.0 mL條件下，分別依照流速1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min進行洗脫，考察不同洗脫流速對解吸率的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當洗脫流速在1.5～2.0 mL/min，解吸率變化大不，當洗脫流速大于2.0 mL/min時，解吸率降低明顯，這可能是因為洗脫流速過高導致洗脫劑不能很好地與樹脂上吸附的黃酮進行交換，若洗脫流速過小，試驗周期將延長[11]，因此確定2.0 mL/min為最適洗脫流速。

2.3.3 動態(tài)解吸曲線與洗脫劑量的考察 在洗脫劑濃度70.0%，洗脫流速2.0 mg/mL條件下，按每管5.0 mL收集洗脫液，依照“1.2.4”中方法檢測每管洗脫液的黃酮濃度，結(jié)果見圖9。由圖9可知，從第1管到第6管，黃酮濃度逐漸上升，第6管后黃酮濃度逐漸下降，第14管黃酮濃度接近零，因此確定70.0 mL為最佳洗脫劑量。

在上樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、上樣量20.0 mL、上樣液pH 5.5的條件下，用40.0 mL蒸餾水按流速1.5 mL/min洗脫后用70.0%乙醇洗脫，洗脫流速2.0 mL/min、洗脫劑量70.0 mL，按每管5.0 mL收集洗脫液，只保留第5、6、7、8、9這5 管洗脫液，濃縮后冷凍干燥。對冷凍干燥所得物再過2次聚酰胺柱，按“1.2.5”中方法對粗品、1次過柱所得物、2次過柱所得物、3次過柱所得物檢測黃酮純度，結(jié)果見表3。

3 小結(jié)

本試驗通過考察6種樹脂對纈草黃酮的靜態(tài)吸附-解吸性能篩選出聚酰胺樹脂，進行動態(tài)吸附-解吸試驗，得到最優(yōu)工藝：以流速1.5 mL/min加黃酮濃度2.0 mg/mL、pH 5.5的樣品液20.0 mL，用40.0 mL蒸餾水以流速1.5 mL/min洗脫后用70.0 mL的70.0%乙醇按流速2.0 mL/min洗脫，經(jīng)3次聚酰胺柱層析的纈草黃酮純度由粗品17.58%提高到79.17%。

聚酰胺柱層析純化纈草黃酮成本低廉，無金屬和毒性溶劑殘留，具有穩(wěn)定可行和操作方便等優(yōu)點，這可為用纈草和黃酮的進一步研究提供支持。

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