向福　付建強(qiáng)　孫白珍等

摘要：為了優(yōu)化金銀花（Lonicera japonica）葉中綠原酸醇浸水提工藝，通過單因素試驗(yàn)篩選pH、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)等關(guān)鍵影響因素，以綠原酸得率為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，提取金銀花葉綠原酸的最佳工藝為pH 4.5、提取時間25 min、浸析乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，該條件下綠原酸的得率可達(dá)6.856%。該工藝合理可行，可用于金銀花葉中綠原酸提取的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：金銀花（Lonicera japonica）葉；響應(yīng)面；綠原酸；水提法

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3727-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.038

Abstract： To optimize the water extraction conditions for chlorogenic acid from flos lonicerae leaves，the key factors such as pH，extraction time，and alcohol concentration were employed to design response surface analysis based on single factor test，with yield of chlorogenic acid as response value.The results showed that the optimum extraction conditions were pH 4.5，extraction time 25 min，and alcohol volume fraction 65%，and under this processtheyield of chlorogenic acid reached 6.856%. So this extraction technology is practically reasonable and suitable for commercial production of chlorogenic acid from flos lonicerae leaves.

Key words： flos lonicerae（Lonicera japonica） leaves； response surface method； chlorogenic acid； water extraction

金銀花（Lonicera japonica）是中國一種藥食兼用的重要中藥材，藥用歷史悠久，由于其顯著的抗菌消炎作用而被譽(yù)為“植物抗生素”。綠原酸是金銀花的一種主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、保肝利膽、升高白細(xì)胞以及清除自由基等作用[1]，廣泛用于醫(yī)藥、保健、衛(wèi)生、化工和食品等領(lǐng)域，也是目前國際公認(rèn)的“植物黃金”[2]。長期以來，由于金銀花葉一直被視為非藥用部位而被大量廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。事實(shí)上，金銀花葉中綠原酸含量豐富，如湖北省黃岡地區(qū)地標(biāo)產(chǎn)品——羅田金銀花的葉中綠原酸的含量高達(dá)7%左右[3]，且其來源豐富、采集容易，是一種成本更為低廉的綠原酸提取原料。因此，從金銀花葉中提取綠原酸已逐漸受到人們的關(guān)注。

工藝優(yōu)化過程中，傳統(tǒng)的單因素和正交試驗(yàn)無法在整個區(qū)域內(nèi)尋求因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，工程應(yīng)用的可信度不夠。響應(yīng)面法是一種周期短、精度高、能探討幾種因素間交互作用的回歸分析方法，有助于通過較少的試驗(yàn)次數(shù)進(jìn)行快速建模，從而提高工程應(yīng)用的可信度[4]。因此，本研究以金銀花葉為原料，采用醇浸水提法提取綠原酸[5]，用紫外分光光度計進(jìn)行檢測，通過響應(yīng)面分析對金銀花葉中綠原酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而為大別山地區(qū)金銀花高附加值產(chǎn)品的精深加工提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：金銀花葉，采于團(tuán)風(fēng)縣方高坪鎮(zhèn)湯鋪嶺村金銀花基地，陰干，粉碎備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號20120117），上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計（Varian Cary 100 Scan，美國Varian公司）；電子天平（Ax-205 METTLER TOLEDO，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-S2AA，上海亞榮生化儀器廠）；超聲波清洗器（SB 25-12DTDN，寧波新芝生物科技有限公司）；pH計[UB-7，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2，北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸得率測定 最大波峰和標(biāo)準(zhǔn)曲線沿用實(shí)驗(yàn)室前期的測定結(jié)果[5]，即檢測波長為323 nm，綠原酸在濃度（X）為5～50 μg/mL范圍與吸光度（Y）呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.043 5X+ 0.021 7，R2=0.999 4。綠原酸得率按式（1）計算：

C=[（A-0.021 7）/0.043 5]×N×V×10-6/m]×100%（1）

式中，C為綠原酸得率，%；V為綠原酸提取液體積，mL；m為金銀花葉的質(zhì)量，g；A為吸光度；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) ①提取溫度對綠原酸提取的影響。稱取5份處理后的金銀花葉粉末10 g置于圓底燒瓶，用適量55%乙醇浸泡12 h后，按液料體積質(zhì)量比20∶1（V∶m，下同）加入pH 4的超純水，在60、70、80、90℃及沸水條件下水浴25 min提取金銀花葉中綠原酸，考察提取溫度對綠原酸提取的影響。②pH對綠原酸提取的影響。稱取5份處理后的金銀花葉粉末10 g置于圓底燒瓶，用適量55%乙醇浸泡12 h后，按液料體積質(zhì)量比20∶1加入pH為2、3、4、5、6的超純水，沸水浴加熱25 min提取金銀花葉中綠原酸，考察pH對綠原酸提取的影響。③提取時間對綠原酸提取的影響。稱取7份處理后的金銀花葉粉末10 g置于圓底燒瓶，用適量55%乙醇浸泡12 h后，按液料體積質(zhì)量比20∶1加入pH 4的超純水，沸水浴分別加熱5、10、15、20、25、30、35 min提取金銀花葉中綠原酸，考察提取時間對綠原酸提取的影響。④浸析醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取的影響。稱取5份處理后的金銀花葉粉末10 g置于圓底燒瓶，分別用適量體積分?jǐn)?shù)為25%、35%、45%、55%、65%的乙醇浸泡12 h后，按液料體積質(zhì)量比20∶1加入pH 4的超純水，沸水浴加熱25 min提取金銀花葉中綠原酸，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取pH、提取時間、浸析醇體積分?jǐn)?shù)3個對金銀花葉中綠原酸提取效果影響較為顯著的因素，以綠原酸得率為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面分析因子與水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對綠原酸提取的影響 從圖1可知，在60～80 ℃時綠原酸提取量迅速增大，然后趨于平緩，直到沸水后達(dá)到最高值，表明醇浸水提工藝中短時溫度達(dá)到80 ℃后滲入細(xì)胞內(nèi)部的乙醇沸騰效果明顯，在沸水條件下提取效果最好。

2.1.2 pH對綠原酸提取的影響 由圖2可知，隨著pH的增大，綠原酸提取量先增加后減少，當(dāng)pH 4時，金銀花葉中綠原酸的提取效果最好，因此適宜條件為pH 4。該結(jié)論與向福等[5]的結(jié)果一致。

2.1.3 提取時間對綠原酸提取的影響 由圖3可知，加熱時間10 min時出現(xiàn)第1個峰值，與向福等[5]的結(jié)果一致。不同的是在25 min出現(xiàn)了最大的峰值，隨后綠原酸量迅速降低。這可能是由于25 min時進(jìn)入金銀花葉孔內(nèi)的乙醇溶液迅速沸騰而強(qiáng)化了提取效果，隨著時間的延長，綠原酸在高溫下易分解，且提取物中的多糖等雜質(zhì)會大量增加，導(dǎo)致綠原酸量迅速降低。因此提取時間以25 min為宜。

2.1.4 浸析醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取的影響 由圖4可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，綠原酸提取量先是快速上升，在55%浸析醇處出現(xiàn)峰值，之后降低。金銀花葉用乙醇進(jìn)行浸泡的過程相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)部綠原酸的解析過程，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)不同對細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的解析能力也是不同的。圖4結(jié)果表明55%乙醇溶液浸析后的金銀花葉進(jìn)行綠原酸提取的效果最佳。需要說明的是，提取過程中涉及到的乙醇用量和提取料液比均參考向福等[5]的結(jié)果。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2中試驗(yàn)編號1～12為析因試驗(yàn)，13～15為中心試驗(yàn)。15個試驗(yàn)點(diǎn)分為零點(diǎn)和析因點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次以估計試驗(yàn)誤差。

利用Design Expert 8.0.5b對所得表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到綠原酸得率（Y）對pH （X1）、提取時間（X2）和浸析醇體積分?jǐn)?shù)（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=-1.236 7+1.871 0X1+0.077 3X2+ 0.084 2X3+3.352 5×10-4X1X2-6.142 5×10-4X1X2-3.587 2×10-4X2X3-0.195 2X12-1.185 6×10-3X22-5.480 2×10-4X32

表3中的方差分析結(jié)果表明，X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32對Y的響應(yīng)值均達(dá)到顯著或極顯著水平，因此，盡管X1、X2、X3 3個因子交互作用對響應(yīng)值Y的影響較小，但各因子與響應(yīng)值之間不存在簡單的線性關(guān)系，綠原酸得率同時也受到二次項(xiàng)的影響。就模型分析結(jié)果表明，描述各因子與響應(yīng)值關(guān)系的回歸模型F為152.79，P<0.000 1，失擬項(xiàng)F為3.37，P>0.1，且預(yù)測擬合度和校正擬合度比較一致，說明該試驗(yàn)方法可靠，模型極顯著。就相關(guān)系數(shù)而言，R2=0.996 4，表明回歸方程中99.64%的因變量變化可以由其自變量的變化進(jìn)行解釋，也就是說在該工藝中，未計入回歸方程的變量對金銀花葉中綠原酸的提取效果影響較小。因此，可用該模型對金銀花葉中綠原酸醇浸水提工藝過程進(jìn)行分析和預(yù)測。

圖5、圖6和圖7是根據(jù)多元回歸方程所生成的響應(yīng)面及其等高線，比較直觀地反映了各因子以及各因子之間的交互作用。各圖表示提取時間、pH、浸析醇體積分?jǐn)?shù)這3個因子中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對綠原酸得率的影響。從圖5～圖7可知，就各個因子而言，pH對綠原酸得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而提取時間與浸析醇體積分?jǐn)?shù)次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較??；就交互影響而言，X1X2之間交互作用較為明顯（圖5中等高線中心呈橢圓狀），X1X3、X2X3之間交互作用不明顯。3個響應(yīng)面均為凸面，開口向下，提取時間、pH、浸析乙醇體積分?jǐn)?shù)3個因子與綠原酸得率基本呈拋物線關(guān)系，在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在最大值。模型預(yù)測的最佳提取工藝條件為：pH 4.71，時間23.4 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，在此條件下，綠原酸得率可達(dá)6.863 7%。

2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證時考慮實(shí)際操作問題，將最佳條件修正為：pH 4.5、提取時間25 min、浸析乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。在浸析12 h、液料體積質(zhì)量比20∶1以及沸水條件下，利用修正后的最佳條件從金銀花葉中用醇浸水提法提取綠原酸，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，綠原酸實(shí)測平均得率為6.856%，與理論預(yù)測值吻合度較高。

3 結(jié)論

醇浸水提工藝中pH、提取時間和浸析乙醇體積分?jǐn)?shù)對金銀花葉中綠原酸的提取影響極顯著；在浸析12 h，液料體積質(zhì)量比20∶1以及沸水條件下提取金銀花葉綠原酸的最佳工藝為：pH 4.5、提取時間25 min、浸析乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，該條件下綠原酸的得率可達(dá)6.856%。該工藝合理可行，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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