劉燕霞， 彭 廷， 趙亞帆， 杜彥修， 張 靜， 李俊周， 趙全志， 孫紅正

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要形式，在維護(hù)基因組穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)控植物發(fā)育等方面具有重要作用[1～3].24-nt siRNA是植物中數(shù)量最多的小RNA，能在基因轉(zhuǎn)錄后水平或轉(zhuǎn)錄水平分別通過切割靶基因和介導(dǎo)DNA甲基化來調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物的生長調(diào)節(jié).目前，多數(shù)研究認(rèn)為，24-nt siRNA主要參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)[4～6]，因此,研究24-nt siRNA表達(dá)量與DNA甲基化之間的關(guān)系，對基因表達(dá)差異形成的原因探討具有重要的指導(dǎo)作用.MORITOH等[2]通過研究水稻中參與DNA甲基化的甲基化酶OSDRM2突變體，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平降低，且參與指導(dǎo)DNA甲基化的siRNA(small interfering RNA，siRNA)表達(dá)量也有所降低.GROSZMANN等[7]認(rèn)為,24-nt siRNA水平降低與DNA甲基化和基因表達(dá)變化有關(guān)，并對雜種優(yōu)勢有作用.通過對大穗型水稻品種新豐2號灌漿過程中5個時期的小RNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)隨著灌漿的持續(xù)，強(qiáng)弱勢粒中24-nt siRNA的表達(dá)量逐漸降低，而且在各個時期弱勢粒中24-nt siRNA的表達(dá)量都高于強(qiáng)勢粒[8].目前,關(guān)于水稻子粒灌漿過程中強(qiáng)弱勢粒間有差異表達(dá)的24-nt siRNA能否引起靶基因甲基化差異的研究未見報道.為了探討強(qiáng)弱勢粒24nt-siRNA表達(dá)量與靶基因DNA甲基化之間的關(guān)系，本研究采用亞硫酸鹽測序法檢測了強(qiáng)弱勢粒中產(chǎn)生大量24-nt siRNAs的靶基因甲基化狀態(tài)，分析DNA甲基化差異，并對強(qiáng)弱勢粒24-nt siRNA與DNA甲基化之間的關(guān)系進(jìn)行討論.

1 材料與方法

1.1材料

以黃淮流域大面積推廣的大穗型粳稻新豐2號為材料，2012-06-18種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū).抽穗開花期選取生長整齊，株型一致，同1 d開花的主穗掛牌標(biāo)記.取花后10 d的小穗，按PENG等[9]的方法分離強(qiáng)弱勢粒，液氮速凍后，于-80 ℃保存.

1.2方法

1.2.1 水稻強(qiáng)弱勢粒24-nt siRNA實時熒光定量PCR驗證 按microRNA實時定量莖環(huán)RT-PCR原理[10]，設(shè)計3對24-nt siRNA引物(表1).新豐2號花后10 d強(qiáng)弱勢?？俁NA的提取用RNA提取試劑盒(TransGen Biotech，Tranzol Plant,ET1201-01)進(jìn)行，然后使用HiFi-MMLV cDNA Kit(康為世紀(jì)，CW0744A)反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 取5 μL按1∶20稀釋的cDNA做模板，配置20 μL含有10 μL UltraSYBR mixture反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參基因，在BioRad Iq5儀器上進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)保溫10 min ，95 ℃變性30 s ，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán).所有PCR均設(shè)置3次重復(fù)，24-nt siRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct方法計算[11].

表1 實時熒光定量qRT-PCR和DNA甲基化檢測引物序列

1.2.2 亞硫酸鹽測序法檢測DNA甲基化狀態(tài) 水稻子粒基因組DNA提取使用基因組提取試劑盒(康為世紀(jì)，CW2298)，提取的基因組DNA用甲基化DNA檢測試劑盒(康為世紀(jì)，CW2140)進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理[12，13].以甲基化處理后的DNA做模板，分別用引物BSP-1F/BSP-1R和BSP-2F/BSP-2R進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，引物序列見表1.反應(yīng)結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(康為世紀(jì)，CW0520)回收PCR產(chǎn)物.回收的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，隨機(jī)挑取15個克隆進(jìn)行測序.

1.2.3 CyMATE在線軟件分析DNA甲基化水平 植物DNA甲基化有3類：對稱性CG,CHG和非對稱CHH(H表示A，T或C)[2].采用HETZL等[14]提出的CyMATE在線軟件(http://www.cymate.org/)分析法分別得到每個克隆的3類胞嘧啶甲基化水平，每個克隆總胞嘧啶甲基化比例為每個克隆3類胞嘧啶甲基化比例之和.以1個克隆作為1次重復(fù)，用Excel軟件統(tǒng)計靶基因區(qū)域胞嘧啶整體甲基化水平(總胞嘧啶甲基化比例)和3類胞嘧啶甲基化水平.

2 結(jié)果與分析

2.1水稻強(qiáng)弱勢粒24-ntsiRNA實時熒光定量驗證

大規(guī)模小RNA測序數(shù)據(jù)結(jié)果表明，新豐2號基因組第12條染色體的1個DNA區(qū)段產(chǎn)生大量24-nt siRNA (圖1).從中選取3個高表達(dá)的24-nt siRNA(siR138309，siR326225，siR95400)，用qRT-PCR方法檢測花后10 d在強(qiáng)弱勢粒中的表達(dá)水平.結(jié)果顯示,3個24-nt siRNA的相對表達(dá)量在強(qiáng)弱勢粒間存在差異，且在弱勢粒中的表達(dá)量都高于強(qiáng)勢粒，與測序結(jié)果一致(圖2).

2.2水稻24-ntsiRNA靶基因甲基化狀態(tài)及差異分析

選定的24-nt siRNA靶基因區(qū)段核苷酸長度為330 bp，以重亞硫酸氫鹽后的水稻強(qiáng)弱勢?；蚪MDNA為模板，采用巢式PCR方法均擴(kuò)增出330 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致.通過克隆測序檢測強(qiáng)弱勢粒中24-nt siRNA靶基因區(qū)段胞嘧啶甲基化狀態(tài)，用CyMATE在線軟件輸出靶基因甲基化狀態(tài)(圖3).

圖1 10個表達(dá)量高的24-nt siRNAs在第1外顯子上的分布

圖中黑色長方框為第1外顯子，方框左右的短線分別代表非編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū).siR138309等10個siRNAs是10個表達(dá)量高的24-nt siRNAs. siR138309下方黑色短方框在黑色長方框上對應(yīng)的位置代表siR138309靶基因在第1外顯子上的分布.

The long black box in the figure represents the first exon region and the single line on the left and right sides of the long black box represents non-coding region and intron region respectively. Ten siRNAs for example siR138309 are ten high expression 24-nt siRNAs. The position of black long box opposited to the short black box below siR138309, show the distribution of siR138309 target genes on the fist exon region.

圖2 24-nt siRNAs大規(guī)模測序豐度(A)和24-nt siRNAs實時熒光定量qRT-PCR驗證(B)

圖3 水稻強(qiáng)弱勢粒DNA甲基化示意圖

實心圖表示胞嘧啶發(fā)生甲基化;空心圖則表示胞嘧啶未發(fā)生甲基化;圓形為CG二核苷酸;方形為CNG三核苷酸;三角形為CHH三核苷酸.S為強(qiáng)勢粒，共有11個克隆;I為弱勢粒，共14個克隆.圖中position對應(yīng)的數(shù)字表示目標(biāo)片段中胞嘧啶所在的位置.

The filled symbols represent cytosine methylation and empty symbols represent unmethylated cytosine. The circles indicate CG, squares for CHG and triangles for CHH. S represent superior grains, and S-1—S-11 represent 11 clones sequenced. I is for inferior grains, and I-1—I-14 for 14 clones sequenced. The numbers at the bottom of the figure indicates the nucleotide position of the cytosine methylation along the sequence alignment.

本試驗中亞硫酸鹽測序檢測的24-nt siRNA靶基因為LOC_Os12g40000的第1個外顯子(209 bp)，共含有80個胞嘧啶，其中CG類型的胞嘧啶25個，占總胞嘧啶的31.25%，CNG類型的胞嘧啶21個，占總胞嘧啶的26.25%，而CHH類型的胞嘧啶有34個，占總胞嘧啶的42.50%.靶基因總胞嘧啶甲基化水平在強(qiáng)弱勢粒間存在顯著差異(P<0.05)，強(qiáng)勢?？偘奏ぜ谆娇蛇_(dá)到82.84%，弱勢粒只有64.02%，強(qiáng)勢粒靶基因甲基化水平高于弱勢粒.CG類二核苷酸胞嘧啶甲基化水平在強(qiáng)弱勢粒間雖然都高達(dá)98%，但沒有差異.組成總胞嘧啶的2類CHG和CHH三核苷酸胞嘧啶甲基化水平在強(qiáng)勢粒中均高于弱勢粒，且CHH差異顯著(P<0.05)(圖4).由于CHG和CHH類胞嘧啶占靶基因總胞嘧啶的72.5%，由此推測，強(qiáng)弱勢粒間CHG和CHH類甲基化差異可能是造成強(qiáng)弱勢粒靶基因甲基化水平差異的主要原因.

3 結(jié)論與討論

水稻基因組中大多數(shù)CG群與基因有關(guān)，而基因與基因之間的甲基化水平差異很小[15].作者檢測到了水稻花后10 d種子發(fā)育中CG，CHG和CHH的3類DNA甲基化狀態(tài).對強(qiáng)弱勢粒間3類DNA甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)弱勢粒中CG類甲基化水平都高但不存在差異，而強(qiáng)勢粒中CHG和CHH類甲基化水平都高于弱勢粒，最終導(dǎo)致強(qiáng)勢粒整體甲基化水平高于弱勢粒.因此，水稻強(qiáng)弱勢粒間高程度的CG甲基化可能是基因存在的標(biāo)志，而強(qiáng)弱勢粒間CHG和CHH甲基化差異可能是在種子發(fā)育過程中形成的.

圖4 水稻強(qiáng)弱勢粒間靶基因總胞嘧啶甲基化水平及3類胞嘧啶甲基化水平

24-nt siRNAs能夠通過RdDM途徑指導(dǎo)序列特異性DNA甲基化和組蛋白修飾[16].通過對新豐2號花后5個時期的測序發(fā)現(xiàn)，24-nt siRNA在弱勢粒的每個時期的表達(dá)量都非常高[8].根據(jù)目前的研究認(rèn)為，相對于強(qiáng)勢粒，弱勢粒中表達(dá)量較高的24-nt siRNA將會導(dǎo)致較高水平的DNA甲基化[3～5].本試驗選取了產(chǎn)生大量24-nt siRNAs的DNA片段，對其胞嘧啶甲基化水平進(jìn)行亞硫酸鹽測序分析，結(jié)果表明，強(qiáng)勢粒中表達(dá)量較低的24-nt siRNA，其靶基因甲基化水平比弱勢粒高.

出現(xiàn)這種情況的一個可能原因是強(qiáng)弱勢粒間24-nt siRNA的差異是DNA甲基化造成的.有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的DNA甲基化，特別是第1個外顯子的甲基化會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平的沉默[17].24-nt siRNA的產(chǎn)生首先需要pol IV轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA，單鏈RNA在RDR2作用下合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈RNA，最后雙鏈RNA由DCL3切割成為24-nt siRNA[18～21].轉(zhuǎn)錄水平的沉默會造成24-nt siRNA產(chǎn)生源頭減少，最終導(dǎo)致24-nt siRNA表達(dá)量降低.本試驗研究的24-nt siRNA靶基因區(qū)域為第1外顯子，強(qiáng)勢粒第1外顯子較高的甲基化水平，可能導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)錄的高度抑制，進(jìn)而引起強(qiáng)勢粒產(chǎn)生較少的24-nt siRNA弱勢粒，反之亦然.因此，弱勢粒24-nt siRNA表達(dá)量高可能是甲基化水平低造成的結(jié)果.

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