李 鋒， 程 雁， 馮 菲， 寧 萌， 陳曉飛， 孫玉飛， 周伏忠

(河南省微生物工程重點(diǎn)實驗室，河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草，屬子囊菌門Ascomycota、 盤菌亞門Pezizomycotina、糞殼菌綱Sordariomycetes、肉座菌亞綱Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、蟲草菌科Cordycipitaceae，是蟲草屬Cordyceps的模式種[1].該菌能寄生多種鱗翅目昆蟲幼蟲及蛹，是一種具有食用和藥用價值的大型真菌.藥理學(xué)研究表明,蛹蟲草具有“性平、味甘、益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰”的功效，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗疲勞、抗腫瘤等功效，能顯著增強(qiáng)非特異性免疫系統(tǒng)及促進(jìn)抗體形成，具有良好的醫(yī)用價值和保健作用[2,3].蛹蟲草與中國傳統(tǒng)名貴中藥冬蟲夏草(Ophiocordycepssinense)在藥化和藥理上十分相似，有些成分甚至遠(yuǎn)高于冬蟲夏草，因此在功能食品、醫(yī)藥和生物學(xué)技術(shù)等方面有較高的實用價值，可以作為冬蟲夏草的代用品[3,4].

蛹蟲草的生態(tài)適應(yīng)幅度大，廣泛分布于世界各地，包括中國、美國、俄羅斯、加拿大、意大利等國，在中國的吉林、湖北、貴州、云南、四川等省均有發(fā)現(xiàn)[5].野生蛹蟲草大多生長在海拔100～2 500 m的山區(qū)，適宜含水量20%～25%、pH值6.5的微酸性土壤，多為棕壤土、紫紅壤土等腐殖質(zhì)土壤.它的自然發(fā)生季節(jié)一般為6～9月份，氣溫15～25 ℃，空氣相對濕度60%～85%，郁閉度60%的針闊混交林地[3].

筆者在河南省汝陽縣的伏牛山區(qū)進(jìn)行生態(tài)調(diào)查時，首次在該地區(qū)發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草的存在，這增加了蛹蟲草在中國的分布地區(qū).通過對菌株分離、形態(tài)鑒定和分子鑒定以及人工培養(yǎng)、纖溶活性測定等分析，為蛹蟲草這一珍稀自然資源的利用提供了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1野生蛹蟲草的生長環(huán)境調(diào)查與外觀特征

觀測蛹蟲草在發(fā)現(xiàn)地的生長環(huán)境，記錄發(fā)現(xiàn)蛹蟲草的地理位置.同時采集數(shù)株野生蛹蟲草，肉眼觀測并記錄外觀形態(tài)，并帶回實驗室中進(jìn)行菌株的分離與鑒定.

1.2蛹蟲草菌株的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

將采集的新鮮蛹蟲草用清水洗去表面浮土，置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中表面消毒2 min，在無菌水中反復(fù)沖洗，置于無菌濾紙上晾干.用無菌解剖刀將消毒后的蟲草子座切成長度0.5～1.0 cm 的小段，接種于PDA 培養(yǎng)基平板上，放置于22 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng).菌絲萌發(fā)生長后，選擇無污染的菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基平板上進(jìn)一步培養(yǎng)，最終得到純化的蛹蟲草菌株，命名為ycc-ry-01.

將蛹蟲草菌株ycc-ry-01接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于22 ℃下黑暗培養(yǎng)5 d，隨后轉(zhuǎn)移至光照(12 h)與黑暗(12 h)交替條件下繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d.每天觀察菌落形態(tài)變化、菌絲的長勢和菌落顏色變化.

蛹蟲草菌絲體以乳酸石碳酸棉蘭溶液制片，野生蛹蟲草的子座做切片，用光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)，分類檢索參照文獻(xiàn)資料[6].

1.3蛹蟲草菌株的分子鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 采用CTAB 法提取野生蛹蟲草和分離培養(yǎng)后的菌株ycc-ry-01菌絲體基因組DNA.取適量子座或菌絲體置于研缽中，加入液氮冷凍研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移到滅菌離心管，加入600 μL CTAB 緩沖液(NaCl 1.4 mol；CTAB質(zhì)量濃度 2%；Tris-HCl 100 mmol，pH值8.0；EDTA 20 mmol，pH值8.0)于65 ℃溫育40 min，中間反復(fù)顛倒3～5次.冷卻到室溫后12 000 r·min-1離心10 min，取上清液加入等體積的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次.小心吸取上層水相，加入等體積的異丙醇，輕微顛倒試管幾次使樣品混勻，置于4 ℃冰箱中過夜.12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇清洗沉淀2～3 次，干燥后用TE 緩沖液溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆?；同時取5 μL樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測.

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用真核生物擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段的擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA 2 μL、10×PCR buffer 5 μL、Taq DNA 聚合酶2.5 Unit、dNTP(2.5mM) 4 μL、引物ITS1和ITS4 (10 μM)各2 μL，用去離子水補(bǔ)至50 μL.反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min 后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性50 s、53 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后于72 ℃下延伸10 min.PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品送交北京華大生物技術(shù)有限公司測序.

1.3.3 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序結(jié)果提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用BLASTN 程序?qū)Λ@得的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列進(jìn)行相似性比對.下載蟲草屬(Cordyceps)相似的物種菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，用ClustalX 2.0 軟件處理分析獲得菌株的ITS 序列，用MEGA 5.0軟件采用最大似然法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹探討其親緣關(guān)系.

1.4蛹蟲草菌株的人工栽培培養(yǎng)

以大米培養(yǎng)基為基質(zhì)對菌株ycc-ry-01進(jìn)行了人工栽培培養(yǎng)，同時以菌株ycc-jzc(來自河南省科學(xué)院食用菌工程技術(shù)中心)作為對照菌株.具體操作過程為：將2種菌株分別接種于PDA 培養(yǎng)基斜面上，22 ℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行活化.將活化后的菌種分別接入50 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，22 ℃震蕩培養(yǎng)5 d作為液體菌種.將30 g 大米和35 mL營養(yǎng)液(100 g·L-1馬鈴薯煎汁1 000 mL；KH2PO42 g；MgSO41 g；檸檬酸銨 1 g；葡萄糖1 g；蛋白胨 1 g；維生素B1，50 mg)裝入罐頭瓶后用耐高溫塑料膜扎緊，121 ℃滅菌40 min.取5 mL不同菌株的液體菌種，無菌操作接入瓶內(nèi)大米培養(yǎng)基上，22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d.待菌絲長滿培養(yǎng)基后，移置于光照下處理，繼續(xù)培養(yǎng)7 d 后在塑料膜上打孔，增加通氣量.再繼續(xù)培養(yǎng)20～50 d，觀察子座的形成與生長情況.

1.5蛹蟲草菌株的纖溶活性測定

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定纖溶活性.菌株ycc-ry-01和菌株ycc-jzc分別采用黃豆培養(yǎng)基(黃豆100 g煎汁30 min、蔗糖20 g、酵母粉2.5 g、MgSO41.5 g，補(bǔ)充水至1 000 mL)、淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g、酵母粉1 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、維生素B1 10 mg，補(bǔ)充水至1 000 mL)、玉米漿培養(yǎng)基(玉米漿3 g、葡萄糖50 g、豆餅粉10 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.5 g，補(bǔ)充水至1 000 mL)3種培養(yǎng)基于22 ℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7 d.培養(yǎng)物進(jìn)行5 000 r·min-1離心10 min，取菌絲體用PBS緩沖液清洗2～3次后，按照濕質(zhì)量1 g·mL-1的量加入PBS進(jìn)行勻漿，12 000 r·min-1離心10 min后取上清液連同發(fā)酵液進(jìn)行纖溶活性的測定.瓊脂糖-纖維蛋白平板的制法：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖7.5 mL，50水浴保溫5 min后，加入凝血酶(100 BP·mL-1) 225 μL，混勻，再進(jìn)行50 ℃水浴保溫5 min后加入7.5 mL纖維蛋白原溶液(3.6 g·L-1)，迅速混勻，倒入平板中.凝固后打孔，加入10 μL樣品，于37 ℃溫浴18 h后測定纖維蛋白平板上的透明圈的直徑大小.

2 結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草的生長環(huán)境與外觀形態(tài)

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多生長在伏牛山區(qū)的山體背陰面，主要分布于針葉與闊葉混交林的地表土層中.發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)的海拔為500 m左右，方位為北緯33.91°、東經(jīng)112.48°.本次考察發(fā)現(xiàn)的蛹蟲草主要寄生在昆蟲蛹上，已經(jīng)長出子座，呈一個或多個分枝.子座通常長3～8 cm，呈棒狀，上半部比下半部寬，上半部分呈橘黃色，有毛刺狀小突起，子囊殼豐富，基部光滑呈暗橙色(圖1).同時發(fā)現(xiàn)了僵死的幼蟲，蟲體布滿白色的菌絲，未見長出子座.

A, B, C：野生蛹蟲草的生長形態(tài)： D：寄生在昆蟲蛹體上的蛹蟲草.

2.2蛹蟲草的形態(tài)特征

顯微鏡下觀測蛹蟲草的子座，可以看到毛刺狀小突起，為子囊殼，呈瓶狀或圓錐狀，埋生或半埋生于子座組織中，內(nèi)有子囊，呈蠕蟲形圓柱形(圖2).每個子囊中有線狀子囊孢子，并排排列.

蛹蟲草分離菌株ycc-ry-01的菌絲為有隔管狀，無色透明.菌落生長初期呈純白色，細(xì)密絨毛狀，中央有丘形突起，菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，邊緣較清晰，見光生長后菌絲逐漸變?yōu)辄S色，表面及平板背面均可見黃色色素分泌(圖2).

根據(jù)上述子座特征和菌絲形態(tài)，結(jié)合《真菌鑒定手冊》的檢索結(jié)果，初步鑒定符合蟲草屬(Cordyceps)的形態(tài)特征.但由于未觀察到子囊孢子的形態(tài)特征，無法采用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行精確鑒定.

2.3蛹蟲草的分子鑒定

采用CTAB法提取了野生蛹蟲草子座和純培養(yǎng)后的菌株ycc-ry-01菌絲體基因組DNA，采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增ITS序列.兩者均獲得了的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小在550 bp 左右(圖3).根據(jù)序列測定結(jié)果，兩者序列完全一致.經(jīng)整理后發(fā)現(xiàn)ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列長度為478 bp，GC含量為56.4%.將獲得的ITS序列與GenBank 中已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行BLASTN檢索比對，結(jié)果顯示，與蛹蟲草C.militaris序列具有高度相似，同源性高達(dá)100%.該結(jié)果也說明，不同的蛹蟲草菌株間的ITS 序列是相對保守的.根據(jù)BLAST檢索結(jié)果，篩選蟲草屬相關(guān)物種的ITS序列與供試菌株的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.結(jié)果表明，樣品菌株ycc-ry-01與蛹蟲草聚于一個分支上，而與其他物種相距較遠(yuǎn)(圖4).

圖2 蛹蟲草的子囊殼(A)和菌落特征(B、C)

綜合形態(tài)特征和分子鑒定的結(jié)果，說明樣品為蛹蟲草(Cordycepsmilitaris).

泳道1、3：來源于野生蛹蟲草子座；泳道2、4：來源于分離菌株ycc-ry-01.

2.4蛹蟲草的人工栽培

采用大米培養(yǎng)基對菌株ycc-ry-01和對照菌株ycc-jzc進(jìn)行了人工栽培培養(yǎng).結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種后7 d左右，白色的菌絲逐漸布滿培養(yǎng)基表面；培養(yǎng)到10～15 d左右時菌絲可以覆蓋培養(yǎng)料，見光后菌絲體由白色逐漸轉(zhuǎn)為桔黃色.此時增加光照時間，促進(jìn)菌絲體轉(zhuǎn)色和刺激原基形成.生長至20～25 d時，培養(yǎng)基表明有突起，形成小米粒狀的原基，采取適當(dāng)通風(fēng)和控制好溫度、濕度以及光照時間后，繼續(xù)培養(yǎng)直至50 d時發(fā)現(xiàn)，在同樣的培養(yǎng)條件下，分離自野生蛹蟲草的菌株ycc-ry-01只能形成原基，不能長出子座，而對照菌株ycc-jzc則順利長出了子座(圖5).

括號內(nèi)數(shù)字表示GenBank的登錄號

2.5蛹蟲草菌株的纖溶活性

分別對菌株ycc-ry-01和對照菌株ycc-jzc在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液和菌絲體提取物進(jìn)行了纖溶活性測定.結(jié)果表明，菌株ycc-ry-01和菌株ycc-jzc在玉米漿培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲體和發(fā)酵液具有明顯的纖溶活性，出現(xiàn)了透明圈；菌株ycc-ry-01的活性要比菌株ycc-jzc的高；同時2株菌株的活性對比來看，菌絲體提取物的纖溶活性要高于發(fā)酵液的活性.而2株菌株在其他2種供試的培養(yǎng)基上無論是菌絲體提取物還是發(fā)酵上清液均無明顯的透明圈出現(xiàn)，說明無纖溶活性(圖6).

A: 培養(yǎng)好的菌種液體種子； B：接種在大米培養(yǎng)基上生長7 d時長出的白色菌絲；C：培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)色后的黃色菌絲；D: 蛹蟲草的原基形成；E: 正在生長的蛹蟲草子座；F: 成熟后收獲的蛹蟲草子座.

3 討論

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，蛹蟲草在河南省的商城、新縣、羅山、信陽、內(nèi)鄉(xiāng)、西峽等地均有分布[7].本研究報道在河南省汝陽縣的伏牛山區(qū)發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草的存在，增加了蛹蟲草的分布地區(qū).這一自然資源在此地的分布，可能與汝陽縣伏牛山區(qū)的氣候溫和，雨量適中，四季分明等北亞熱帶季風(fēng)區(qū)大陸性特征氣候有關(guān).由于伏牛山區(qū)的地形復(fù)雜，林地眾多、植被豐富，適應(yīng)多種鱗翅目昆蟲生長繁衍；落葉腐殖土層厚、營養(yǎng)豐富，這些自然條件為蛹蟲草的生長和繁殖提供了有利的條件，同時近年來當(dāng)?shù)卣訌?qiáng)了封山育林、水土保護(hù)，也與生態(tài)環(huán)境的改善等有密不可分的關(guān)系.

人工栽培是充分利用蛹蟲草和解決野生蛹蟲草來源不足的良好途徑.然而在人工培養(yǎng)過程中，影響蛹蟲草子座(子實體)形成的因素很多，總的來說可以分成：培養(yǎng)條件與環(huán)境因素(外因)、菌株的遺傳背景因素(內(nèi)因)[8].本研究中采用大米培養(yǎng)基對分離的菌株ycc-ry-01進(jìn)行了人工培養(yǎng)，結(jié)果只能形成原基，不能長出子實體，而對照菌株ycc-jzc則順利長出了子實體，這說明與菌株的遺傳背景因素有直接關(guān)系.李美娜等[9]對同一標(biāo)本上分得2個形成子實體能力差異的菌株進(jìn)行了分子分析，試驗發(fā)現(xiàn)兩者在DNA水平上發(fā)生很大的遺傳變異，也證實了子座的形成與菌株的遺傳背景有直接關(guān)系.因此，這一方面的相關(guān)研究值得進(jìn)行深入探索.

A：蛹蟲草菌絲體提取物的纖溶活性. 1，5：PBS溶液作為對照； 2，3，4：菌株ycc-jzc分別在黃豆、淀粉、玉米漿培養(yǎng)基上獲得菌絲體；6，7，8：菌株ycc-ry-01分別在玉米漿、淀粉、黃豆培養(yǎng)基上獲得菌絲體；B：蛹蟲草的發(fā)酵液的纖溶活性.1，5，9分別為黃豆、淀粉、玉米漿等3種培養(yǎng)基液作為對照；2，3，4：菌株ycc-jzc分別在玉米漿、淀粉、黃豆培養(yǎng)基上獲得發(fā)酵液；6，7，8：菌株ycc-ry-01分別在玉米漿、淀粉、黃豆培養(yǎng)基上獲得發(fā)酵液.

血栓性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病之一，溶栓抗栓藥物的研發(fā)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn).許多研究人員逐漸將目光投向食藥用菌來獲得安全性高、副作用小、療效好的天然溶栓藥物，并相繼在金針菇Flammulinavelutipes、糙皮側(cè)耳Pleurotusostreatus和灰樹花Grifolafrondosa等上有所發(fā)現(xiàn)[10～13]，而對于蛹蟲草的纖溶活性也引起了越來越多學(xué)者的重視[11, 14, 15].對菌株ycc-ry-01和ycc-jzc在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的菌絲體和發(fā)酵液進(jìn)行了纖溶活性測定和比較，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草的纖溶活性受培養(yǎng)基成分的影響很大，菌株ycc-ry-01在玉米漿培養(yǎng)基上無論是菌絲體還是發(fā)酵液均表現(xiàn)較好的活性，菌絲體的活性高于發(fā)酵液的活性，說明蛹蟲草的纖溶活性物質(zhì)受到某些培養(yǎng)基成分的誘導(dǎo)表達(dá)，主要存在于胞內(nèi)，也可以分泌到胞外，因此對這些纖溶活性物質(zhì)的提取和純化，以及進(jìn)一步研究其性質(zhì)和進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)，可為蛹蟲草這一珍稀資源的利用提供基礎(chǔ).

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