張君瑩，吳建中，季明華，張 燁，尹 麗，徐 濤，羅 舟，馬 蓉，曹海霞，唐金海

乳腺癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，居女性惡性腫瘤之首，遠處轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在此過程中起到了重要作用。MMPs通過降解細胞外基質(zhì)以及細胞間接觸等方式促進上皮細胞與周圍組織分離，促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。VEGF是目前已知的最關(guān)鍵、作用最強的血管生長刺激因子，促進毛細血管袢形成并向瘤體內(nèi)延伸，加速腫瘤組織生長，此外通過增加血管通透性，協(xié)助腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng)，促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。VEGF和MMPs均參與惡性腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移過程，且兩者可能存在協(xié)同作用[1]。相較于傳統(tǒng)的ELISA等檢測方法，液相芯片分析技術(shù)有其明顯優(yōu)勢，芯片技術(shù)靈敏度更高，精確值亦可達到0.01 pg/ml。本研究通過高通量液相芯片技術(shù)檢測了正常人、良性乳腺纖維瘤和乳腺癌患者血清MMP-9和VEGF的表達，旨在探討其表達水平在乳腺癌臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2011年9月至2012年12月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的384例患者以及未罹患乳腺相關(guān)疾病的正常人40例，均為女性，其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(infiltrative ductal carcinoma, IDC) 301例，其中有118例IDC患者于術(shù)后復(fù)查VEGF、MMP-9；乳腺纖維瘤患者83例，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實。根據(jù)國際抗癌協(xié)會UICC建議的TNM分期將IDC組分為Ⅰ期125例，Ⅱ期58例，Ⅲ期98例，Ⅳ期20例；其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為127例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為166例，未查到有無轉(zhuǎn)移為8例。本研究符合倫理學(xué)要求，口頭告知實驗情況并經(jīng)患者同意簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集 抽取患者及正常人清晨空腹靜脈血3 ml，將采集的靜脈血放于無內(nèi)毒素和熱源的試管中，上下振搖3次，室溫凝血30 min后2 500 rpm/min離心10 min。吸取血清，分裝后放于-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 儀器與試劑 本實驗檢測方法采用液相芯片分析技術(shù)，F(xiàn)LEXMAP 3DTM(三維)系統(tǒng)由Luminex公司(USA)提供。用來檢測血清中VEGF和MMP-9的試劑盒Human Cytokine/Chemokine和Human CVD Panel 1均購自上海Millipore貿(mào)易有限公司。

1.4 實驗步驟 操作步驟嚴(yán)格遵循說明書。將收集在-80 ℃的血清放置4 ℃解凍，取200 μl血清至96孔板?；旌暇鶆蛩芰现榕c緩沖液，將混懸液每孔25 μl加至標(biāo)本檢測板中。然后逐步加入陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品和待測標(biāo)本，25 μl每孔(以上操作均在冰上進行)。依次加入檢測緩沖液，每孔25 μl。于室溫中振搖標(biāo)本檢測板，VEGF：16 h，MMP-9：2 h。洗板兩次后，每孔50 μl加入檢測抗體至標(biāo)本檢測板。室溫振搖1 h，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白液。兩次洗板完畢后每孔100 μl向標(biāo)本檢測板中加入洗液。室溫中振搖5 min。蛋白質(zhì)全定量檢測，開機預(yù)熱30 min，設(shè)定儀器參數(shù)為如下，Events：50；Gate：8 000～15 000；Sample Size：VEGF 100 μl，MMP-9 50 μl；Time Out：60 s；Bead Region：VEGF 86#，MMP-9為27#。在檢測池中放入標(biāo)本檢測板，運行相關(guān)檢測程序。最后用Xponent 4軟件分析檢測中產(chǎn)生的微球中位熒光讀數(shù)，并獲得最終結(jié)果，以上實驗均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗。兩組間比較采用獨立樣Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用獨立樣本Kruskal-Wallis單因素檢驗。兩因子間相關(guān)分析采Spearman等級相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用ROC曲線下面積分析評估血清中VEGF和MMP-9的水平對IDC患者的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中VEGF和MMP-9的表達 各組血清中VEGF和MMP-9的水平見表1,血清中VEGF和MMP-9在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中的表達明顯高于乳腺纖維患者和正常人(均P<0.05)。

表1 各組血清中VEGF、MMP-9的比較

2.2 手術(shù)治療后IDC患者血清中VEGF和MMP-9的變化 118例IDC患者術(shù)后復(fù)查血清VEGF、MMP-9表達量分別(135.26±131.20) pg/ml和(680.36±551.77) ng/ml，與術(shù)前的(180.89±167.82) pg/ml和(903.92±704.76) ng/ml相比，表達水平明顯下降(均P<0.05)。

2.3 VEGF和MMP-9與臨床病理特征的關(guān)系 IDC患者血清中VEGF和MMP9與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系見表2。乳腺癌患者血清中VEGF、MMP-9表達水平與年齡無關(guān)(均P>0.05)；而與臨床分期、原發(fā)灶大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.01)。

表2 MMP-9和VEGF與未治療組乳腺浸潤性導(dǎo)管癌IDC臨床病理特征的關(guān)系

2.4 VEGF和MMP-9兩者間的相關(guān)性 用Spearman秩和檢驗分析顯示血清中VEGF和MMP-9兩者的表達水平呈正相關(guān)性(r=0.601，P<0.01)，如圖1所示。

圖1 VEGF和MMP9的相關(guān)性分析

2.5 VEGF和MMP-9對于IDC的診斷價值 VEGF的ROC曲線下面積為0.788(95%置信區(qū)間：0.711～0.864)，而MMP-9曲線下面積為0.861(95%置信區(qū)間:0.806～0.916)。由此可見，血清VEGF和MMP-9對于IDC的診斷均具有一定的可信性。

圖2 VEGF和MMP-9對于IDC診斷價值的ROC曲線

3 討論

新生血管形成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其為腫瘤細胞提供營養(yǎng)、氧氣，同時血管內(nèi)皮細胞通過旁分泌作用及產(chǎn)生腫瘤生長啟動因子，直接促進乳腺癌細胞生長。腫瘤血管的生成一般是促進血管生成因子和抑制血管生成因子之間達到了某種動態(tài)平衡的結(jié)果。在眾多促血管生成因子中，VEGF已經(jīng)被公認(rèn)為是作用很強的因子之一，其是一種內(nèi)皮細胞中特異性的有絲分裂原，通過與血管生成血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)結(jié)合，強有力的增加血管通透性。MMP-9則可以通過調(diào)節(jié)VEGF的生物利用度從而同樣促進腫瘤血管生長，也可調(diào)節(jié)生成的腫瘤血管的穩(wěn)定性和滲透性。

本研究結(jié)果顯示，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)、乳腺纖維瘤以及正常人群中，IDC組VEGF和MMP-9的表達量明顯高于后兩者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，良性病變?nèi)橄倮w維瘤組與正常人對比，前者血清VEGF和MMP-9的表達水平略高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩者表達水平與腫瘤的TNM分期關(guān)系密切。有文獻報道表明，隨著TNM分期的進展，血清VEGF的表達水平也隨之升高[2]。另有報道無論在三陰性乳腺癌中還是雌激素依賴的乳腺腫瘤中，MMP-9的表達水平也隨著IDC的臨床病理分期的提高而增加[3]。本研究結(jié)果與以上報道結(jié)果結(jié)論相一致。進一步分析VEGF和MMP-9與腫瘤大小以及年齡的關(guān)系，研究結(jié)果顯示VEGF和MMP-9的表達和腫瘤大小關(guān)系密切，隨著腫瘤體積的增大，VEGF和MMP-9的表達水平呈現(xiàn)上升趨勢。此與Goldhirsch等[4]及Rakha等[5]的研究結(jié)果相似。故我們認(rèn)為患者血清中VEGF和MMP-9的表達水平與原發(fā)灶大小存在相關(guān)性，可以從某種程度上預(yù)測乳腺癌預(yù)后。本研究顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中VEGF和MMP-9的水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。VEGF能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，增加細胞的滲透性，容易造成腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而MMP-9則能夠破壞基底膜，導(dǎo)致癌細胞向遠處轉(zhuǎn)移。因此，VEGF和MMP-9的表達水平在一定層面上可以預(yù)示IDC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的高低。

此外，我們在分析研究VEGF和MMP-9的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，二者之間存在正相關(guān)。Riedel等[6]曾經(jīng)報道VEGF和MMP-9之間存在著協(xié)同作用，可以作為腫瘤血管生成與腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志。Zucker等[7]發(fā)現(xiàn)VEGF能夠間接促進MMP-9的分泌并增加其活性。因此，聯(lián)合檢測VEGF和MMP-9的表達對于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測價值。

本研究通過液相芯片分析技術(shù)在血清中檢測因子，較之外科手術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附等方法，其具有以下顯而易見的優(yōu)點：芯片技術(shù)靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA 法高2～3個數(shù)量級，檢測值可以精確到0.01 pg/ml。液相環(huán)境對于生物大分子的天然構(gòu)象保持更有利，利于探針與檢測物的反應(yīng)；血樣標(biāo)本容易收集，成本較低，創(chuàng)傷小，患者接受程度高，容易操作，術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后均可檢測，可重復(fù)性好。利用液相芯片技術(shù)檢測血清中核酸、蛋白質(zhì)生物大分子，如臨床細胞因子、腫瘤標(biāo)志物等，較傳統(tǒng)ELISA法更準(zhǔn)確、靈敏與快速，高通量，重復(fù)性好，節(jié)省樣品和時間。

當(dāng)然，僅在血清中檢測VEGF和MMP-9可能有所局限。因為有研究表明血小板會釋放VEGF至血清中，血清中的VEGF和血小板的計數(shù)高度相關(guān)。因此，有學(xué)者認(rèn)為檢測血漿中VEGF對于反映血循環(huán)中VEGF更精準(zhǔn)[8]。關(guān)于VEGF和MMP-9對于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的預(yù)后等關(guān)系將來需要進行大規(guī)模的研究證實。

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