王亞東，楊留才

(1.阜寧縣人民醫(yī)院普外科，江蘇 阜寧 224400； 2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

胃癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其主要的病理類型是胃腺癌，其發(fā)病率僅次于肺癌居所有惡性腫瘤的第二位。最近的研究表明，胃癌的發(fā)病率逐年上升，對人們的生命健康造成了很大的威脅[1]。研究顯示,胃癌患者的組織學(xué)類型、病理分化、轉(zhuǎn)移等臨床指標(biāo)與腫瘤組織中不同基因的表達(dá)密切相關(guān),對胃癌患者預(yù)后地評估具有很大的臨床參考價值[2]。其中，生存蛋白(livin)是凋亡抑制蛋白家族成員之一，主要在乳腺癌[3]、食管癌[4]等實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，通過抑制胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-9等凋亡因子的活性來發(fā)揮其阻斷細(xì)胞凋亡過程的生理功能[5]。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，其主要的功能是負(fù)責(zé)水解大量底物蛋白[6]。同時caspase-3也是細(xì)胞凋亡通路下游最重要的效應(yīng)分子，凋亡通路一旦激活就會引起caspase-3級聯(lián)反應(yīng)并使其活化，最終引起細(xì)胞凋亡[7]。本研究通過免疫組織化學(xué)染色的方法研究livin與caspase-3在胃腺癌癌組織中的表達(dá)情況，并且探討兩者在胃腺癌的臨床診斷和預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月至2012年6月在阜寧縣人民醫(yī)院普外科就診進(jìn)行手術(shù)治療，并且經(jīng)過病理診斷確診為胃癌的蠟塊標(biāo)本114例作為胃癌組，其中男68例、女46例，年齡39～74(47.2±6.6)歲；按照年齡進(jìn)行分類，年齡<60歲者71例，年齡≥60歲者43例；按照國際抗癌聯(lián)盟臨床分期標(biāo)準(zhǔn)對胃癌患者進(jìn)行分期，Ⅰ期23例，Ⅱ期27例，Ⅲ期36例，Ⅳ期28例；病理診斷為高分化27例，中分化47例，低分化30例，未分化10例；術(shù)后病理診斷確認(rèn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，所有胃癌患者在進(jìn)行手術(shù)之前均未經(jīng)過化療等治療措施。標(biāo)本均采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。另外，取病理診斷為正常胃黏膜的蠟塊標(biāo)本46例作為對照組，標(biāo)本來自于胃潰瘍切除術(shù)或者十二指腸切除術(shù)的患者，均通過病理診斷排除了高度不典型增生，其中男31例、女15例，年齡36～76(46.9±6.5)歲。胃癌組和對照組的性別、年齡等一般資料具有均衡性。

1.2免疫組織化學(xué)染色方法 石蠟切片使用梯度乙醇脫蠟水化，微波抗原修復(fù)5 min，3%過氧化氫孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，加兔抗人livin一抗(1∶100,美國Santa Cruz公司)和兔抗人caspase-3一抗(1∶200,美國Santa Cruz公司)，室溫過夜，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗，加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶100，美國Sigma公司)室溫孵育40 min；磷酸鹽緩沖液清洗，DAB底物液(中國邁新公司)顯色20 min，蘇木精復(fù)染30 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察攝片。

1.3染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Livin和caspase-3均定位于胞質(zhì)中，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞標(biāo)志。在高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，根據(jù)陽性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽性細(xì)胞比例<5%判斷為(-)，陽性細(xì)胞比例≥5%判斷為(±)[5,7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Livin和caspase-3在不同組織中的表達(dá)情況 Livin在胃癌組的陽性表達(dá)率高于對照組(χ2=66.74，P<0.05)；caspase-3在胃癌組的陽性表達(dá)率低于對照組(χ2=68.01，P<0.05)(表1)。

表1 Livin和caspase-3在不同組織中的表達(dá)情況

2.2Livin和caspase-3在胃腺癌組織中表達(dá)以及與臨床、病理指標(biāo)的關(guān)系 不同性別、年齡的livin和caspase-3陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同臨床分期、組織分化、腫瘤浸潤深度以及淋巴轉(zhuǎn)移與否的livin和caspase-3陽性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 Livin和caspase-3在胃腺癌癌組織中表達(dá)以及與臨床、病理指標(biāo)的關(guān)系 (例)

2.3Livin和caspase-3在胃腺癌癌組織表達(dá)的相關(guān)性 在胃腺癌組織中，livin和caspase-3陽性表達(dá)率分別為77.19%和15.79%，Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示：兩者在胃腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.56，P<0.05)(表3)。

表3 Livin和caspase-3在宮頸鱗癌組織表達(dá)的相關(guān)性 (例)

3 討 論

目前的研究表明，致癌因子引發(fā)的細(xì)胞增殖和凋亡的失衡與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[8]，其中caspase家族蛋白[9]、Bcl-2家族蛋白[10]和p53[11]等細(xì)胞因子在凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中均發(fā)揮重要的生理功能。本研究結(jié)果顯示，livin在胃癌組的陽性表達(dá)率高于對照組(P<0.05),且其與臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P<0.05)。本研究結(jié)果和Liang等[12]的研究結(jié)果一致。

Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中caspase-3是caspase家族中最重要的細(xì)胞因子，其主要功能是負(fù)責(zé)水解全部或部分負(fù)責(zé)大量底物[6]。凋亡通路激活caspase-9，caspase-9引起caspase-3活化，并且發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，caspase-3在胃腺癌組織中的陽性率較正常胃黏膜組織低，通過對胃腺癌患者的臨床和病例指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，caspase-3在胃腺癌組織中的陽性表達(dá)率和臨床分期、病理分級、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。本研究結(jié)果與卵巢癌[13]、乳腺癌[14]患者的研究結(jié)果基本相同。

此外，本研究結(jié)果還顯示，livin與caspase-3在胃腺癌癌中的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)，提示livin可能通過影響caspase-3的表達(dá)水平來抑制胃腺癌細(xì)胞的凋亡。目前的研究認(rèn)為，livin調(diào)節(jié)凋亡主要通過以下兩種途徑：①livin直接下調(diào)caspase-3的表達(dá)水平，抑制死亡受體途徑來減少凋亡；②livin通過與caspase-9結(jié)合，使caspase-9失活，從而間接降低caspase-3的活性，抑制線粒體途徑來減少凋亡[15]。

綜上所述，livin與caspase-3在胃腺癌癌組織表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并且均與臨床分期、病理分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這提示livin可能通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

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