馬增翼

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 神經(jīng)外科，上海201907）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的25%，是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的高度惡性腫瘤（WHO IV級(jí)），其生存期短，死亡率高，治療困難［1］。目前，普遍推薦的GBM標(biāo)準(zhǔn)治療方案是手術(shù)后同步放化療＋6個(gè)療程的替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療，其平均 生 存 期 僅 12 ～ 15mon［2，3］。EORTC-NCIC（EORTC：歐洲癌癥研究治療組織；NCIC：加拿大國(guó)立癌癥研究院）隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)結(jié)果提示：經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后，GBM 總體平均生存期為14.6mon［4］，結(jié)果均不盡人意。由此可見(jiàn)，深入研究GBM發(fā)病機(jī)制，完善診療途徑，是現(xiàn)今GBM重要研究方向。

隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的認(rèn)識(shí)也進(jìn)入到基因水平，2008年TCGA（The Cancer Genome Atlas，癌癥基因圖譜）發(fā)表的文章分析了GBM的3條關(guān)鍵信號(hào)通路［5］，兩年后，其又結(jié)合臨床預(yù)后結(jié)果等，將GBM分為原神經(jīng)型、神經(jīng)型、經(jīng)典型和間質(zhì)型等四型［6］。期間大量的基因測(cè)序，DNA拷貝分析，基因表達(dá)譜篩查都使用了基因芯片技術(shù)—通過(guò)微加工技術(shù)，對(duì)成千上萬(wàn)的腫瘤堿基順序進(jìn)行自動(dòng)化，高效率的分析。對(duì)GBM的分子表達(dá)特征進(jìn)行綜述，旨在為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷、治療以及預(yù)后有關(guān)的基因通路表達(dá)的研究拓展思路。

1 基因芯片簡(jiǎn)介

1.1 基因芯片技術(shù)與原理

基因芯片（genechip）（又稱DNA芯片，生物芯片）技術(shù)指通過(guò)微加工技術(shù)，將大量特定序列的基因探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾?，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲得樣品分子的數(shù)量和序列信息。之后隨著探針固相原位技術(shù)及照相平版印刷以及激光共聚焦顯微技術(shù)的引入，使得基因芯片技術(shù)以其快速、高效、自動(dòng)化平行處理等特點(diǎn)，迅速在突變基因檢測(cè)、基因表達(dá)譜篩查、雜交測(cè)序等方面展露頭角。

基因芯片的原型是二十世紀(jì)八十年代中期提出的?；蛐酒臏y(cè)序原理是雜交測(cè)序方法：通過(guò)與一組已知序列的核酸探針進(jìn)行雜交，從而進(jìn)行核酸序列的測(cè)定。基因芯片可以分為三種主要類型：① 固定在聚合物基片上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影檢測(cè)。②用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上DNA探針陣列，多用于檢測(cè)DNA的變異。③ 硬質(zhì)表面直接合成的寡核苷酸探針陣列?；玖鞒贪ǎ盒酒脑O(shè)計(jì)與制備，樣品的制備標(biāo)記，生物分子雜交反應(yīng)，信號(hào)的檢測(cè)。

1.2 基因芯片特點(diǎn)及在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

基因芯片的優(yōu)點(diǎn)是能夠提高效率，減低單個(gè)芯片成本，特別適用于大規(guī)模的基因信息采集與分析。基因芯片可以同時(shí)將大量的核酸探針固定在支持物上，一次性的對(duì)大量樣品序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印記雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、操作數(shù)量少等缺陷［6］。同時(shí)，該技術(shù)還具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)序、實(shí)變檢測(cè)、多態(tài)性分析等。

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展都伴隨著復(fù)雜的基因表達(dá)的改變。通過(guò)采用基因芯片技術(shù)，可以高效的篩查與腫瘤侵襲力、分級(jí)等有關(guān)的基因表達(dá)異常及通路，了解表現(xiàn)形式和基因水平的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，從而在揭示出新的重要腫瘤相關(guān)基因的同時(shí)，為進(jìn)一步基因靶向個(gè)體化治療尋求新的道路。

2 基因芯片在膠質(zhì)瘤基因分析研究中的應(yīng)用

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)信號(hào)通路的研究

TCGA重點(diǎn)分析了3條GBM的核心通路：酪氨酸激酶受體（RTKs）信號(hào)，P53信號(hào)肽和RB介導(dǎo)的控制細(xì)胞周期進(jìn)展通路。之后，對(duì)相關(guān)通路的研究進(jìn)展迅速。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，三條重要通路RTK／RAS／PI-3K、P53和 RB信號(hào)變化分別為88%、87%和78%，其中74%的異常在三個(gè)途徑同時(shí)存在，暗示著三條路徑的異常存在有一個(gè)共同的發(fā)病機(jī)制［5］。Karisa等在TCGA的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)PTEN，TP53和RB1進(jìn)行后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，PTEN、TP53和RB1通路的改變是在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病中肯定要發(fā)生的機(jī)制。他們通過(guò)誘導(dǎo)上述基因失活，發(fā)現(xiàn)在PI-3K和RB通路中，Pten或Rb基因的缺失是始發(fā)事件［7］。Karisa等通過(guò)使用伽馬分泌酶抑制劑（MRK-003）抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等方式，研究了GBM的NotchHedgehog，和 Wnt三個(gè)通路，也得出相似的結(jié)論：盡管抑制了Notch通路，并且伴隨有Wnt和Hedgehog通路的正向活化，GBM對(duì)長(zhǎng)期的MRK-003治療仍有部分耐藥［8］，且各通路之間的關(guān)系還有待研究。深入了解已知各通路的相互聯(lián)系和對(duì)GBM發(fā)病機(jī)制的影響將會(huì)是重要研究方向。

2.2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤差異性基因表達(dá)的研究

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，染色體7的擴(kuò)增和染色體10的缺失是高頻發(fā)生的。典型的亞型除此之外還有EGFR的擴(kuò)增且缺失TP53的突變。原神經(jīng)亞型多有高富集的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記。此外，典型的亞型和鼠的星形細(xì)胞有很強(qiáng)的正相關(guān)。神經(jīng)亞型則顯示出一個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的區(qū)別，而且富集了神經(jīng)元的基因差別表達(dá)。間質(zhì)亞型則與星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)簽緊密關(guān)聯(lián)［9］。對(duì)于NF1基因的研究表明，盡管在人腦膠質(zhì)瘤中，NF1基因的突變只是一個(gè)小的系列［9］，但在206例患者樣品中，至少47例存在NF1基因的失活或者缺失［5］。同時(shí)，Morante等人研究發(fā)現(xiàn)，減少CCAAT／增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C／E）b的表達(dá)可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。C／E是一種和代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和增殖相關(guān)的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。減少其表達(dá)，可以讓GBM細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0／G1的邊界，并減少了它們的轉(zhuǎn)化和遷移能力［10］。

2.3 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分型后的個(gè)體化治療前景

通過(guò)用分子和基因組技術(shù)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分型的最大優(yōu)勢(shì)不僅在于可以對(duì)每個(gè)腫瘤患者進(jìn)行有針對(duì)性的個(gè)體化治療，同時(shí)可以幫助患者降低用藥風(fēng)險(xiǎn)。在多元化輔助治療的今天，根據(jù)亞型的不同，有針對(duì)性的為患者選擇放化療、免疫治療或者靶向治療提供非常堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。有12%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和70%的神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在IDH1突變。2009年，馬薩諸塞州劍橋Agios藥物制劑公司的科學(xué)家報(bào)道，突變的IDH1酶促進(jìn)產(chǎn)生了 （R）-2-hydroxyglutarate，一種和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥相關(guān)聯(lián)的代謝產(chǎn)物。這些科學(xué)家們正在尋找藥物抑制這種變異酶的活性［11］。其結(jié)果奠定了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域個(gè)性化治療的基礎(chǔ)，同時(shí)也為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型異種移植模型的建立提供支持。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的能力是一個(gè)阻礙免疫治療成功的重大障礙。Waldron等［12］報(bào)道，PTEN癌抑制基因缺失，聯(lián)合活化PI3K／Akt／mTOR通路，導(dǎo)致人神經(jīng)膠質(zhì)瘤表型誘導(dǎo)的T細(xì)胞自動(dòng)凋亡，說(shuō)明PTEN基因缺失的患者不適合聯(lián)合T細(xì)胞免疫治療。

目前，最大的輔助治療定義為同時(shí)放化療，或超過(guò)3個(gè)后續(xù)周期的化療。在注冊(cè)的臨床試驗(yàn)（http：／／clinicaltrials.gov／）中，Temozolomide（TMZ）被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，其中針對(duì)GBM的就有208項(xiàng)試驗(yàn)。但是根據(jù)TCGA的分型研究，典型亞型和間質(zhì)亞型的患者經(jīng)過(guò)上述治療明顯降低死亡率，但是對(duì)于神經(jīng)亞型只存在降低死亡率的趨勢(shì)，而對(duì)于原神經(jīng)亞型沒(méi)有證據(jù)證明可以增加生存狀態(tài)［13］。一些專家以此為基礎(chǔ)，完成了對(duì)整個(gè)基因組的甲基化綜合分析，同時(shí)完成了基因表達(dá)文庫(kù)后發(fā)現(xiàn)，并不是每個(gè)患者都需要常規(guī)的手術(shù)及放療和替莫唑胺化療，MGMT甲基化的腫瘤患者，如果其TBX3，DGKI，和FSD1啟動(dòng)子在甲基化的狀態(tài)，則不存在使用替莫唑胺化療的價(jià)值，而不建議使用［14］。根據(jù)Verhaak等的經(jīng)典分型，間質(zhì)亞型的GBMs對(duì)放療更加敏感，而經(jīng)典的GBMs對(duì)一線化療反應(yīng)更好［9］，Ducray等［15］發(fā)現(xiàn)，如果患者的P16缺失，那么無(wú)論其 MGMT啟動(dòng)子的甲基化情況如何，其輔助化療效果都是明顯的，如果P16基因存在，那么輔助化療只有對(duì)MGMT啟動(dòng)子甲基化的患者有效果。

基因芯片已經(jīng)廣泛用于人體腫瘤分析，其高效率、大信息量等特點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)越于傳統(tǒng)的基因分析法。通過(guò)基因芯片篩查膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的差異性表達(dá)基因，可以深入探討發(fā)病機(jī)制，還可以針對(duì)腫瘤分型進(jìn)行靶向個(gè)體化治療。通過(guò)基因芯片和臨床的緊密結(jié)合，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，攻克膠質(zhì)母細(xì)胞瘤會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。

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