金玉蘭，王玉榮

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物和人的消化道中，對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收起著非常重要的作用[1]。蛋白酶也是目前工業(yè)中不可或缺的一類重要工業(yè)酶，約占世界總酶量的60%，在食品、藥品加工、日用化學(xué)品及皮品毛皮工業(yè)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[2-4]。目前，商業(yè)化蛋白酶按來(lái)源分為動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶，隨著國(guó)內(nèi)外魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚(yú)類胃腸道蛋白酶的研究越來(lái)越受到關(guān)注。水生動(dòng)物腸道微生物所產(chǎn)的蛋白酶類與其它動(dòng)物腸道所產(chǎn)的蛋白酶類相比，有著其獨(dú)特的特點(diǎn)，如：低溫下催化活性高、低熱下穩(wěn)定性強(qiáng)和耐酸或耐堿等[5-7]。近年來(lái)，關(guān)于魚(yú)類胃腸道蛋白酶分離純化及性質(zhì)研究的報(bào)道很多，從魚(yú)類胃腸道提取的蛋白酶成為現(xiàn)代工業(yè)化酶制劑的主要來(lái)源之一[8-9]。

作者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)從長(zhǎng)蛸胃腸道分離出的產(chǎn)蛋白酶菌Planomicrobiumsp.L-2菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定該菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，為該菌株在發(fā)酵罐及工業(yè)化條件下進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化提供了理論依據(jù)，同時(shí)為海洋動(dòng)物的進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑、培養(yǎng)基與儀器

Planomicrobiumsp.L-2菌株(菌種保藏號(hào) No.6638)，篩選自長(zhǎng)蛸胃腸道，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。

偶氮酪蛋白(azocasein)、福林酚,美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2216E基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.1 g，磷酸高鐵0.01 g，海水100 mL，pH值7.8～8.0，121 ℃滅菌15 min。

PH-211型臺(tái)式酸度測(cè)定儀，意大利哈納公司；IS-RDV3型立式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DU-800型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)貝克曼公司。

1.2　發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在2216E基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖作為碳源，25 ℃下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，根據(jù)酶活力高低確定最佳碳源。

1.2.2氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、酪蛋白、硝酸鈉作為氮源，25 ℃下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，根據(jù)酶活力高低確定最佳氮源。

1.2.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別將初步優(yōu)化后的培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0，25 ℃下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，根據(jù)酶活力高低確定最佳培養(yǎng)基初始pH值。

1.2.4發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至最佳后，接入活化后的Planomicrobiumsp.L-2，分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃下180 r·min-1培養(yǎng)3 d，根據(jù)酶活力高低確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將活化的Planomicrobiumsp.L-2接入最佳初始pH值的培養(yǎng)基中，在最佳發(fā)酵溫度下，180 r·min-1培養(yǎng)5 d，期間每12 h取樣一次，根據(jù)酶活力高低確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別按5%～12%的接種量，將活化的Planomicrobiumsp.L-2菌懸液接種到初始pH值為8.0的培養(yǎng)基中，在25 ℃下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3.5 d，根據(jù)酶活力高低確定最佳接種量。

1.3　響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選用可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏為考察因素，利用Design Expert 8.05設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析 (RSA) 實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)因子和編碼水平見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)的因素及編碼水平

1.4　酶活力的測(cè)定

酶活力測(cè)定采用Azocasein測(cè)定方法[10]。取1%偶氮酪蛋白溶于0.02 mol·L-1pH值8.0的 PBS緩沖溶液中作為底物，準(zhǔn)確吸取50 μL粗酶樣品與50 μL 1%偶氮酪蛋白充分混勻，37 ℃下140 r·min-1水浴振蕩反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入300 μL 10%(質(zhì)量濃度)TCA終止反應(yīng)，常溫靜置15 min后，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液100 μL，加入1 mol·L-1NaOH 100 μL，充分混勻，于450 nm處測(cè)吸光度A，計(jì)算酶活力。

酶活力單位定義：每分鐘蛋白酶水解底物偶氮酪蛋白使吸光度改變0.001個(gè)單位所需的酶量為1 U。

酶活力計(jì)算公式：

式中：A為450 nm處的吸光度；400為反應(yīng)的總體積；100為反應(yīng)后所取上清液的量,μL；50為所加樣品的量，μL；1 000為從微升轉(zhuǎn)化為毫升的轉(zhuǎn)化系數(shù)；60為反應(yīng)時(shí)間,s。

1.5　蛋白酶含量的測(cè)定

蛋白酶含量測(cè)定采用Bradford 測(cè)定方法。取濃度為0 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、125 μg·mL-1、150 μg·mL-1、175 μg·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，各加考馬斯亮藍(lán)工作液1 mL混勻，室溫放置2 min后在595 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合線性回歸方程為：y=0.0202x+0.0242，R2=0.9981。

圖1　Bradford 法標(biāo)準(zhǔn)曲線

取樣品溶液100 μL,加考馬斯亮藍(lán)工作液1 mL混勻，室溫靜置2 min，在595 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白酶含量。

1.6　生長(zhǎng)量的測(cè)定

采用比濁度法測(cè)定Planomicrobiumsp.L-2的生長(zhǎng)曲線。將Planomicrobiumsp.L-2菌株接入搖瓶培養(yǎng)基中，25 ℃下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，間隔不同時(shí)間取1 mL發(fā)酵液，稀釋至恰當(dāng)倍數(shù)，在600 nm處測(cè)定菌懸液吸光度。

2　結(jié)果與討論

2.1　Planomicrobium sp.L-2菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)蛋白酶過(guò)程(圖1)

由圖1可知，菌株在0～8 h時(shí)為生長(zhǎng)延滯期，菌株處于適應(yīng)環(huán)境的階段；8～16 h時(shí)菌株適應(yīng)環(huán)境后，利用培養(yǎng)基中提供的營(yíng)養(yǎng)成分呈指數(shù)關(guān)系快速生長(zhǎng)；16 h后達(dá)到穩(wěn)定期，菌株濃度最高。與生長(zhǎng)相比，Planomicrobiumsp.L-2菌株合成蛋白酶明顯滯后，在0～24 h 蛋白酶活性增加迅速，24 h 以后增速減緩。

圖2　Planomicrobium sp.L-2菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)蛋白酶過(guò)程

2.2　碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源既是細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的基本物質(zhì)，也是某些酶的誘導(dǎo)物，選擇適宜的碳源有利于定向促進(jìn)某些酶的合成[11]。碳源對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖3所示。

圖3　碳源對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，本實(shí)驗(yàn)中所選擇的碳源都可被Planomicrobiumsp.L-2菌株利用產(chǎn)生蛋白酶，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活力最高，為958 U·mL-1。故選擇最佳碳源為可溶性淀粉。

2.3　氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖4所示。

由圖4可知，蛋白胨對(duì)蛋白酶活力的促進(jìn)作用最明顯，其次為牛肉膏，而硫酸銨、硝酸鈉、酪蛋白對(duì)蛋白酶活力的促進(jìn)作用較弱。這可能是因?yàn)?，蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶，其生物合成受底物及其類似物的誘導(dǎo)，也易受到氨基酸或銨鹽等易利用氮源的阻遏[12]。故選擇最佳氮源為蛋白胨。

圖4　氮源對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

2.4　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖5所示。

圖5　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

研究表明，弱堿性培養(yǎng)環(huán)境更有利于蛋白酶的產(chǎn)生。由圖5可知，在pH值為8.0時(shí)，菌株產(chǎn)酶的活力達(dá)到最高，為1 248 U·mL-1，低于或高于該pH值，菌株的產(chǎn)酶活力則顯著降低。故選擇最佳培養(yǎng)基初始pH值為8.0。

2.5　發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵溫度對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖6所示。

由圖6可知，發(fā)酵溫度對(duì)Planomicrobiumsp.L-2的產(chǎn)酶活力有明顯的影響，在20～25 ℃時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活力較高，25 ℃時(shí)最高，為1 148 U·mL-1，超過(guò)25 ℃后，菌株的產(chǎn)酶活力下降。故選擇最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖6　發(fā)酵溫度對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

2.6　發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖7所示。

圖7　發(fā)酵時(shí)間對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵3.5 d時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活力最高，為1 195 U·mL-1。這可能是因?yàn)?，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，有毒代謝物質(zhì)增多，發(fā)酵液pH值發(fā)生變化，抑制了菌株的正常生理活動(dòng)，導(dǎo)致菌體的衰退從而引起酶的生物合成減少。故選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為3.5 d。

2.7　接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種量對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)酶的影響如圖8所示。

由圖8可知，不同接種量對(duì)菌株的產(chǎn)酶活力的影響差異不顯著。接種量為8%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活力最高，為1 210 U·mL-1。接種量過(guò)低，菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)；接種量過(guò)大，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，菌體很容易衰老，影響蛋白酶的合成[13]。故選擇最佳接種量為8%。

2.8　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.8.1回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

圖8　接種量對(duì)Planomicrobium sp.L-2產(chǎn)酶的影響

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，對(duì)Planomicrobiumsp.L-2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到Planomicrobiumsp.L-2菌株產(chǎn)蛋白酶活性(Y)對(duì)可溶性淀粉(A)、蛋白胨(B)、酵母膏(C)的多項(xiàng)回歸方程為:Y=896.10+1526.53A+1208.33B-10194.17C-191.67AB+4600.00AC+8483.33BC-1436.11A2-1733.33B2+19500.00C2。

對(duì)該模型及系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，P<0.0001，回歸模型顯著，說(shuō)明方程擬合度較好，失擬項(xiàng)P=0.1949>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，說(shuō)明模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度良好，模型選擇正確。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9775，表明所建立的回歸二次模型成立，可用此模型分析和預(yù)測(cè)Planomicrobiumsp.L-2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基組成。

根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖，分別反映了可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏兩兩交互作用對(duì)Planomicrobiumsp.L-2產(chǎn)蛋白酶活力的影響，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，當(dāng)可溶性淀粉添加量一定時(shí)，蛋白酶活力隨著蛋白胨添加量的增加而增大，但當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿看笥?.55%時(shí)，蛋白酶活力逐漸降低；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿恳欢〞r(shí)，蛋白酶活力隨著可溶性淀粉添加量的增加而增大，但當(dāng)可溶性淀粉添加量繼續(xù)增大時(shí)，蛋白酶活力逐漸降低。此外，從響應(yīng)面圖及方差分析可知，在各因素的影響中，酵母膏對(duì)蛋白酶活力影響最大，可溶性淀粉次之，蛋白胨最弱。

利用Design Expert 8.05軟件包，結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出Planomicrobiumsp.L-2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最佳條件是：可溶性淀粉(A)0.73%、蛋白胨(B)0.68%、酵母膏(C)0.15%。在此條件下，預(yù)測(cè)蛋白酶的最高酶活力為1 449 U·mL-1。

2.8.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)Planomicrobiumsp.L-2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的可靠性，在優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵，培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉0.73%、蛋白胨0.68%、酵母膏0.15%、磷酸高鐵0.01%，培養(yǎng)基初始pH值8.0，接種量8%，25 ℃培養(yǎng)3.5 d,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得蛋白酶的平均酶活力為1 457 U·mL-1，與理論值偏差0.55%，說(shuō)明此模型準(zhǔn)確可靠。

圖9　各因素之間交互影響對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面分析圖

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以蛋白酶活力為考察指標(biāo)，建立了Planomicrobiumsp.L-2發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定該模型合理可靠。優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件為：用海水配制含可溶性淀粉0.73%、蛋白胨0.68%、酵母膏0.15%、磷酸高鐵0.01%的培養(yǎng)基，調(diào)培養(yǎng)基初始pH值8.0，接種量為8%，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3.5 d。優(yōu)化后，所產(chǎn)蛋白酶的最高酶活力為1 457 U·mL-1，比優(yōu)化前提高約2倍。

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