李曉彤，江　凌,2，胡　燚，朱麗英，徐　嫻

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210009)

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)即三?；视王；饷?，是一種特殊的酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化油脂的水解反應(yīng)，生成脂肪酸和甘油、甘油單酯或二酯[1-2]。脂肪酶通常被用于在非水相體系中催化油脂及其它一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化以及酯類逆向合成等反應(yīng)[3-5]，由于其高效專一、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，已被應(yīng)用于化工、食品、制藥等領(lǐng)域[6]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)脂肪酶A(LipA)是最小的脂肪酶之一，屬于α/β-折疊水解酶。2001年，Pouderoyen等[7]報(bào)道了LipA的晶體結(jié)構(gòu)特征，這是第1個(gè)獲得解析的芽孢桿菌脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，LipA缺乏多數(shù)脂肪酶都具有的α-螺旋形成的“蓋子結(jié)構(gòu)”，因此，在油水界面和有機(jī)溶劑中都有催化活性，沒(méi)有其它脂肪酶具有的“界面激活”效應(yīng)[8]。并且，與其它脂肪酶的保守的五肽序列Gly-X-Ser-X-Gly不同，LipA的保守序列為Ala-X-Ser-X-Gly(Ser參與組成活性中心催化三聯(lián)體)，這一結(jié)構(gòu)特征與真菌(Candidaantarctica)脂肪酶 B(CALB)很相似[9]，這表明LipA更接近于真菌脂肪酶而不是細(xì)菌脂肪酶。正是由于LipA獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，使其在手性藥物中間體拆分領(lǐng)域具有巨大潛力，已引起廣泛關(guān)注[10]。然而，LipA是一個(gè)常溫酶，最適溫度僅為25 ℃，野生型的LipA在50 ℃下的酶活力僅為最適溫度下的一半[11]。較差的熱穩(wěn)定性限制了它在工業(yè)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用，但是也為其穩(wěn)定性改造提供了進(jìn)化空間，也使得LipA成為了一個(gè)理想的改造對(duì)象。

研究表明，通過(guò)單一氨基酸殘基的置換來(lái)降低蛋白質(zhì)去折疊時(shí)的骨架熵可以使蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性得到一定的提高，而脯氨酸(Pro)在這一理論中起關(guān)鍵作用[12]。Pro的N-Cα旋轉(zhuǎn)受到其吡咯烷環(huán)的束縛，從而具有更小的構(gòu)象自由度，同時(shí)限定其前面氨基酸只有有限的構(gòu)象空間，這種結(jié)構(gòu)使得它比其它氨基酸更能增加蛋白質(zhì)的剛性。相對(duì)地，甘氨酸(Gly)由于沒(méi)有側(cè)鏈，具有靈活的構(gòu)象，則可增加蛋白質(zhì)的柔性[12-14]。對(duì)此，Suzuki等[15]、Watanabe等[16]提出了“脯氨酸理論”，認(rèn)為只要主鏈構(gòu)象不發(fā)生驟變，在適當(dāng)?shù)摩?轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)卷曲位置引入Pro，就可以通過(guò)降低蛋白質(zhì)去折疊時(shí)的骨架熵提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。這一理論已應(yīng)用于多種酶的熱穩(wěn)定性改造實(shí)驗(yàn)并得到了證實(shí)[14,17-18]。

結(jié)合“脯氨酸理論”，作者采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，通過(guò)分析LipA的Rmsf圖及其分子結(jié)構(gòu)模型，確定位于柔性較高Loop區(qū)域的Gly52和Gly158作為突變位點(diǎn)，將Gly突變?yōu)镻ro,并通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，分別考察了野生型LipA和突變株LipAG52P、LipAG158P的比活力、耐溫性等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　菌株及載體質(zhì)粒

Bacillussubtilis168，自行保藏。

EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21 (DE3)、pET-22b質(zhì)粒，Novagen公司。

1.2　培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，用蒸餾水配制，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌 20 min。

LB 固體培養(yǎng)基：在 LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加 1.5%～2.0%的瓊脂。

1.3　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1LipA基因的獲取及PCR擴(kuò)增

提取Bacillussubtilis168基因組(采用Takara公司的提取基因組試劑盒)，根據(jù)Genbank中枯草芽孢桿菌基因組的序列(登錄號(hào)為AL009126.3)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)PCR引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增并回收PCR產(chǎn)物：

上游引物：5′-CCGCATATGGCTGAACACAA-TC-3′；

下游引物：5′-CCCAAGCTTATTCGTATTCTGGC-3′。

上下游引物的5′-端分別設(shè)計(jì)了NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)用于連接到表達(dá)載體pET-22b，以Bacillussubtilis168菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.3.2LipA基因與質(zhì)粒的酶切

在含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增含有質(zhì)粒的菌株，提取質(zhì)粒(采用Takara公司的提取質(zhì)粒試劑盒)。

選擇NdeⅠ和HindⅢ為酶切位點(diǎn)，對(duì)Bacillussubtilis168基因組和pET-22b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切操作，質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物去磷酸化后與LipA基因連接，核酸電泳驗(yàn)證。

1.3.3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中構(gòu)建DH5α-pET22b-LipA，涂布含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)并保存。

1.4　LipA基因的定點(diǎn)突變和蛋白表達(dá)

1.4.1全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增

采用全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)含有Gly52Pro和Gly158Pro的全質(zhì)粒PCR引物，序列如下：

引物1：

S鏈：5′-CGCCATTTATAACAATCCACCGGT-3′；

A鏈：5′-ACCGGTGGATTGTTATAACTTGG-G-3′；

引物2：

S鏈：5′-CGCCATGTTGGACACATCCCCCT-3′；

A鏈：5′-GCTGTACAGAAGGGGGATGTCTTGGG-3′。

用PrimSTAR對(duì)全質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)液：5×Prime STAR Buffer (Mg+plus) 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4 μL，Prime2 (10 μmol·L-1) 1 μL，模板DNA<200 ng，PrimeSTAR HS、DNA Polymerase (2.5 U ·μL-1)各0.5 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)充至50 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為629 bp。

1.4.2全質(zhì)粒擴(kuò)增的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，立即放入冰中融化。加入10 μL連接產(chǎn)物在冰上冷卻30 min，將混合物在42 ℃熱休克90 s(勿搖晃)，立即放到冰浴中冷卻2 min，再加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下振蕩培養(yǎng)30 min，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，構(gòu)建LipA突變株。酶切鑒定篩選重組表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其測(cè)序以確定突變克隆。

1.4.3LipA的誘導(dǎo)表達(dá)

提取DH5α-pET22b-LipA和突變株質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)載體E.coliBL21 (DE3)中，構(gòu)建LipA 工程菌BL21-pET22b-LipA，涂布含有氨芐青霉素的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子于含50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)約2 h，當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)到0.5 mmol·L-1，置于30 ℃搖床上繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5　LipA的分離和純化

將發(fā)酵液離心，收集菌體，用與發(fā)酵液同等體積的Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.4)重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，至菌液澄清后于12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液，即為L(zhǎng)ipA的粗酶液。采用Ni柱親和層析的方法對(duì)粗酶液進(jìn)行純化后,置于4 ℃環(huán)境下保存。SDS-PAGE電泳驗(yàn)證純化效果。

1.6　酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.6.1酶活力測(cè)定

采用p-NPP法測(cè)脂肪酶活力，并繪制p-NP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中分別加入240 μL底物溶液與10 μL酶液(空白對(duì)照加入10 μL蒸餾水)，40 ℃下反應(yīng)10 min，于405 nm處測(cè)定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

酶活力單位定義：每分鐘催化p-NPP水解生成1 μmol的p-NP所需的脂肪酶量為1 U。

1.6.2蛋白濃度測(cè)定

采用Bradford法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別測(cè)定原始菌與突變菌發(fā)酵液中蛋白濃度。

1.6.3熱穩(wěn)定性測(cè)定

將野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P分別于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃下保溫30 min，測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)溫浴條件下所測(cè)得的酶活力為100%，將經(jīng)過(guò)不同溫度熱處理后所測(cè)得的酶活力折合為相對(duì)剩余酶活力，對(duì)溫度作圖。相對(duì)剩余酶活力為50%所對(duì)應(yīng)的溫度為酶的Tm值。

1.6.4動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

使用SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)測(cè)定LipA和LipAG52P、LipAG158P動(dòng)力學(xué)參數(shù)，每30 s測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度，對(duì)時(shí)間作圖。根據(jù)米氏方程力計(jì)算Km、kCat等相關(guān)參數(shù)。

1.7　分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用GROMACS4.5.4軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，體系在中性條件下，溶劑模型SPC，力場(chǎng)為GROMOS9653a6，溫度為300 K。體系首先采用最速下降法能量最小化(steepest descent)進(jìn)行優(yōu)化；然后固定蛋白，采用壓力(parrinello-rahman)與溫度(V-rescale)進(jìn)行500 ps約束優(yōu)化；最后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，放松蛋白，時(shí)間步長(zhǎng)為2 fs，模擬時(shí)間為10 ns。體系每隔1 ps收集一次數(shù)據(jù)，得出分析均方根偏差RMSD(root mean square deviation)值與均方根漲落Rmsf(root mean square fluctuation)曲線。

2　結(jié)果與討論

2.1　突變位點(diǎn)的確定

圖1　LipA三維結(jié)構(gòu)模型

采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，得到野生型LipA的Rmsf值(圖2)。Rmsf值越高則分子柔性越大、穩(wěn)定性越低，從而確定野生型LipA柔性較高的區(qū)域(第151～156位、第109～124位、第130～138位、第38～48位)。結(jié)合上述LipA晶體結(jié)構(gòu)，選取位于柔性較高Loop區(qū)域附近的Gly殘基作為突變位點(diǎn)突變?yōu)镻ro，分別確定為Gly153、Gly155、Gly158、Gly111、Gly116、Gly46、Gly52。

圖2　野生型LipA在300 K平衡時(shí)間段的Rmsf值

2.2　分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)突變體的熱穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)采用GROMACS4.5.4軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)聯(lián)合分析均方根漲落Rmsf值(圖2)與均方根偏差RMSD值(圖3)，分析引入的Pro突變位點(diǎn)對(duì)LipA熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)。

圖3　野生型和突變株LipA的RMSD值隨時(shí)間變化的演示圖

由圖3可知，6 000 ps后蛋白的構(gòu)象趨于穩(wěn)定，最終2 ns時(shí)野生型LipA的平均RMSD值為(0.59±0.01) nm，突變株LipAG52P和LipAG158P的平均RMSD值分別為(0.43±0.02) nm和(0.44±0.02) nm，低于野生型LipA；而其它5種突變株LipAG153P、LipAG155P、LipAG111P、LipAG116P、LipAG46P的平均RMSD值均高于野生型LipA。RMSD值越低則分子構(gòu)象越穩(wěn)定，因此得到提高LipA熱穩(wěn)定性的重要氨基酸位點(diǎn)是Gly52和Gly158(圖4)。

圖4　突變位點(diǎn)3D結(jié)構(gòu)模型

2.3　突變體的獲得

經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ酶切鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果表明：突變表達(dá)質(zhì)粒pET22b-LipAG52P、pET22b-LipAG158P構(gòu)建成功，其電泳圖譜如圖5所示。

2.4　酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)特性的測(cè)定

粗酶液經(jīng)Ni柱純化后，采用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證純化過(guò)程中各收集液的蛋白條帶，如圖6所示。

由圖6可知，酶液最終僅為一條大小為20.1 kDa的單一條帶，達(dá)到了理想的純化效果。

測(cè)得野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P的酶活力、Km值等相關(guān)參數(shù)如表1所示。

由表1可知，LipAG52P、LipAG158P的比活力分別是野生型LipA的5.6倍和2.7倍，LipA的催化效率(kCat/Km)為5.21×10-2L·mmol-1·min-1，LipAG52P和LipAG158P的催化效率分別較LipA提高了85%(9.65×10-2L·mmol-1·min-1)和22%(6.35×10-2L·mmol-1·min-1)。

1，3：LipAG52P、LipAG158P質(zhì)粒　2，4：Nde Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切處理后LipAG52P、LipAG158P質(zhì)粒片段　M：DNA Marker

M.DNA Marker　1～5.純化過(guò)程中各個(gè)階段收集的流出液

表1　野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)

由圖7可知，各溫度下處理30 min后突變株的殘余酶活力均比野生型LipA高。在40 ℃處理30 min后，野生型LipA的殘余酶活僅為32.14%，而突變株LipAG52P和LipAG158P的殘余酶活分別為78.35%和63.51%。在50 ℃處理30 min后，野生型LipA喪失

2.5　熱穩(wěn)定性分析(圖7)

圖7　野生型LipA、LipAG52P和LipAG158P的熱穩(wěn)定性

了90%的酶活，LipAG158P喪失了近80%的酶活，而LipAG52P仍保留了60%的殘余酶活。此外，野生型LipA的Tm值為38 ℃，LipAG52P和LipAG158P的Tm值則分別提高了15 ℃和7 ℃。這說(shuō)明LipAG52P、LipAG158P的熱穩(wěn)定性較野生型LipA有明顯的提高。

2.6　討論

趙博等[20]采用定向進(jìn)化的方法經(jīng)過(guò)兩輪易錯(cuò) PCR以及高通量篩選，最終獲得了比活力為野生出發(fā)酶4.5倍的突變體。Le等[21]通過(guò)A162C和K308C雙突變使CALB的Tm值提高了8.5 ℃。蔡少麗等[22]利用重疊延伸PCR方法對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶基因進(jìn)行體外定點(diǎn)突變，得到的雙突變體脂肪酶PEL-ep8-K115R-GS的Tm值比野生型脂肪酶PEL-GS提高3.5 ℃?？梢?jiàn)，蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)與改造能改善酶的熱穩(wěn)定性。

本研究以LipA(PDB：1I6W)為研究對(duì)象，在計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上將“脯氨酸理論”應(yīng)用于LipA的熱穩(wěn)定性改造上，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬分析其三維結(jié)構(gòu)找出相關(guān)的脯氨酸位點(diǎn)，并預(yù)測(cè)定點(diǎn)突變LipA后對(duì)其熱穩(wěn)定性的影響。既避免了現(xiàn)有技術(shù)中非理性設(shè)計(jì)方法需要面臨的篩選容量大、過(guò)程復(fù)雜等難題，同時(shí)簡(jiǎn)化了理性設(shè)計(jì)方法，使得蛋白質(zhì)的定點(diǎn)突變更具有針對(duì)性，并最終成功實(shí)現(xiàn)了LipA的熱穩(wěn)定性的顯著提高，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到的突變株LipAG52P、LipAG158P不僅比活力和熱穩(wěn)定性均強(qiáng)于野生型LipA，而且催化效率也得到了一定的提高。

3　結(jié)論

以LipA為研究對(duì)象，根據(jù)從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的晶體結(jié)構(gòu)，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行脂肪酶熱穩(wěn)定性位點(diǎn)突變的理性設(shè)計(jì)。首先，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬獲得晶體結(jié)構(gòu)中柔性較高的Loop區(qū)域；進(jìn)而，結(jié)合“脯氨酸理論”，將位于該區(qū)域附近的Gly殘基突變?yōu)镻ro，分析引入Pro突變對(duì)LipA熱穩(wěn)定性的影響，篩選得到Gly52和Gly158兩個(gè)突變位點(diǎn)；最后，通過(guò)定點(diǎn)突變操作對(duì)突變株LipAG52P和LipAG158P進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，突變株LipAG52P、LipAG158P的比活力分別是野生型LipA的5.6倍和2.7倍，Tm值分別提高了15 ℃和7 ℃，并且催化效率分別提高了85%和22%。

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