余　梅，阮小文，譚麗泉，盧玉娟

(1.廣東石油化工學院化學工程學院,廣東 茂名 525000；2.茂名市環(huán)境科學研究所,廣東 茂名 525000)

白腐真菌(white rot fungi)是一種能夠引起木材白色腐朽病的擔子菌,它可以在木質細胞腔內產生胞外氧化酶,該酶具有很強的降解木質素大分子的能力,其降解過程包括木質素碳水化合物結合體的分解、苯基丙烷的分解、側鏈分解以及芳香環(huán)結構的開裂[1]。白腐真菌主要通過分泌非專一性的降解酶系以單電子氧化、共代謝及脂肪過氧化等途徑進行降解活動。白腐真菌的降解酶系統(tǒng)主要包括3種酶：木質素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)、漆酶(laccase，Lac)，這3種酶都具有多種各自的同工酶，白腐真菌的降解能力與這些酶的產生密切相關。而Pasti等[2]研究表明MnP單獨作用同樣可以降解多種不同類型的污染物。

MnP與LiP一樣，都是代表一系列具有糖基的胞外過氧化物酶，因二者都含有血紅素，又稱血紅素過氧化物酶。相對于其它過氧化物酶，MnP的特別之處在于它的底物是有機酸。MnP可以氧化Mn2+為Mn3+，而Mn3+可以螯合有機酸，這種螯合物可通過擴散離開酶活性中心，在過氧化氫存在時能氧化酚型木質素及木質素模型物，即由 Mn2+及一種螯合物催化木質素發(fā)生降解。MnP對木質素的降解有賴于大量穩(wěn)定的Mn3+的存在，與其它酶一起能把木質素徹底降解為二氧化碳[3-4]。

近年來，直接應用MnP解決環(huán)境污染問題逐漸受到人們的關注，而提高MnP的合成水平及其酶活性表達是強化白腐真菌對難降解有機物降解作用的關鍵所在。

由于黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium，以下簡稱P.c.菌)具有十分強烈的降解木質素的能力，因此以其作為研究對象，通過研究P.c.菌搖瓶培養(yǎng)體系在藜蘆醇、苯甲醇、吐溫80以及不同的金屬陽離子等活性因子的影響下的生長及MnP酶活的變化規(guī)律，以確定該菌合成MnP的最優(yōu)條件，為研究P.c.菌產MnP提供一定的科學依據。

1　實驗

1.1　菌種、試劑與儀器

P.c.菌(5.776)，廣州微生物菌種保藏中心。

藜蘆醇、吐溫80、苯甲醇、MgSO4·7H2O、CuSO4、CaCl2等均為分析純，天津大茂化學試劑廠。

YXQ-LS-30S11型立式壓力蒸汽滅菌器、THZ-92B型氣浴恒溫振蕩器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LRH-150B型培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠；800型離心機，上海精密科學儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2　培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(用于繼代培養(yǎng))：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、硫胺素8 mg·L-1、瓊脂18 g·L-1。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基(用于制備孢子懸浮液)：除不加瓊脂外，成分同馬鈴薯固體培養(yǎng)基。

液體限氮培養(yǎng)基[5](用于產酶反應體系)：每升液體培養(yǎng)基中含0.2 g KH2PO4、0.05 g MgSO4·7H2O、0.01 g CaCl2、10 g葡萄糖、1 mg VB1、1 mL無機溶液、1.2 mmol酒石酸銨，其中無機溶液組分及含量見表1。

表1　液體限氮培養(yǎng)基中無機溶液的組分及含量/(mg·L-1)

1.3　化學試劑及金屬離子對P.c.菌生長及MnP酶活的影響[6-7]

將斜面上的菌種接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基平板上于30 ℃下培養(yǎng)7～8 d。用馬鈴薯液體培養(yǎng)基配制孢子懸浮液。

取30 mL液體限氮培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌30 min后接入3 mL孢子懸浮液，分別加入不同濃度的藜蘆醇、苯甲醇、吐溫80及Ca2+、Fe2+、Cu2+等活性因子，于30 ℃、160 r·min-1的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，反應液于3 000 r·min-1下離心10 min，取上清液即為粗酶液。 測定體系中P.c.菌的生物量及MnP 酶活。以不加活性因子的產酶體系為對照。

1.4　分析測試

1.4.1生物量的測定

采用細胞干重法[8]。

1.4.2MnP酶活的測定

取去離子水1 mL、1 mmol·L-1的MnSO4溶液0.4 mL、酒石酸/酒石酸鈉緩沖溶液(pH值5.0) 1.2 mL、粗酶液1 mL，最后加入1 mmol·L-1的過氧化氫溶液(現配)0.4 mL啟動反應，用紫外可見分光光度計檢測混合液在238 nm處3 min內吸光度值的變化。

MnP酶活定義為：1 min內氧化1 μmol Mn2+所需的酶量為一個酶活單位(1 U)[9]。

2　結果與討論

2.1　藜蘆醇濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的藜蘆醇濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結果見圖1。

圖1　藜蘆醇濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖1可知，在藜蘆醇濃度為0～200 mg·L-1時，可以促進P.c.菌生長，隨著藜蘆醇濃度的增大，菌生物量增加；在濃度為150 mg·L-1時，菌生物量達到最大，為0.0751 g；之后隨著藜蘆醇濃度增大菌生物量降低，在濃度達到250 mg·L-1時低于對照組。而較低濃度的藜蘆醇(<10 mg·L-1)對MnP酶活沒有促進作用；之后隨著藜蘆醇濃度的增大,MnP酶活增大，在濃度為150 mg·L-1時達到最大，為406.12 U·L-1，約為對照組的2倍；濃度繼續(xù)增大到250 mg·L-1時，MnP酶活比對照組小，表明此時對產酶起抑制作用。由菌生物量及MnP酶活可知，藜蘆醇濃度小于200 mg·L-1時對P.c.菌的生長及產錳過氧化物酶效果較好。藜蘆醇學名 “3,4-二甲氧基苯甲醇”，在該產酶體系中是P.c.菌在次生代謝階段自身合成并分泌到胞外的活性因子，主要作用是作為還原底物誘導MnP的合成。所以在反應體系中添加一定量的藜蘆醇，對提高MnP酶活是有利的[10-11]。

2.2　苯甲醇濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的苯甲醇濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的生物量及MnP酶活，結果見圖2。

圖2　苯甲醇濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖2可知，隨著苯甲醇濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均增大，在苯甲醇濃度為150 mg·L-1時，菌生物量及MnP酶活均達到最大；之后隨著苯甲醇濃度的增大，菌生物量及MnP酶活呈下降趨勢，說明高濃度的苯甲醇會抑制MnP酶的產生；當苯甲醇濃度達到250 mg·L-1時，MnP酶活低于對照組。苯甲醇具有與藜蘆醇相似的結構，可以在一定程度上替代藜蘆醇作為誘導劑，促進P.c.菌產酶。

2.3　吐溫80濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的吐溫80濃度分別為0 mg·L-1、1.4 mg·L-1、2.8 mg·L-1、7 mg·L-1、14 mg·L-1、28 mg·L-1、42 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結果見圖3。

圖3　吐溫80濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖3可知，在低濃度條件下，隨著吐溫80濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均顯著增大；在吐溫80濃度為7 mg·L-1時菌生物量達到最大，為0.0872 g，之后隨著吐溫80濃度的增大而顯著減小，在28 mg·L-1時低于對照組；而MnP酶活則在吐溫80濃度為14 mg·L-1時達到最大，為490.72 U·L-1，之后隨著吐溫80濃度的增大，酶活略有下降，總體變化不明顯。吐溫80是非離子型的表面活性劑，濃度較低時，可提高微生物細胞膜的滲透性[12]，促使細胞內的酶透過細胞膜分泌出來，有利于酶的合成。吐溫80對MnP酶活的影響主要體現在基團對酶的吸附上，當吐溫80濃度大于臨界膠束濃度(14 mg·L-1)后，形成的膠束對酶具有吸附作用，可能對MnP酶活產生了抑制[13]。

2.4　Ca2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的Ca2+濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1、20 mg·L-1、25 mg·L-1、30 mg·L-1、35 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結果見圖4。

圖4　Ca2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖4可知， Ca2+濃度對P.c.菌的生長及產MnP酶活有很大的影響,隨著Ca2+濃度的增大，菌生物量和MnP酶活增大；在Ca2+濃度為25 mg·L-1時,兩者均達到最大，分別為0.0531 g和701.48 U·L-1；之后隨著Ca2+濃度的增大，菌生物量及MnP酶活減小，但是總體呈促進作用。Ca2+是微生物生長所必需的元素，能有效防止MnP發(fā)生熱失活，有利于菌的生長及產酶。但是高濃度Ca2+可能會與真菌相互作用，引起菌生理過程的變化，從而抑制其生長。

2.5　Fe2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的Fe2+濃度分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1、10 mg·L-1、12 mg·L-1、14 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結果見圖5。

圖5　Fe2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖5可知，Fe2+的添加有效地促進了P.c.菌的生長及MnP酶活；在Fe2+濃度低于8 mg·L-1時，菌生物量及MnP酶活均隨著Fe2+濃度的增大而增大；在Fe2+濃度為6～8 mg·L-1時的產酶效果較好,菌生物量達到0.1026 g，MnP酶活達到646.1 U·L-1；當Fe2+濃度大于8 mg·L-1后，菌生物量及MnP酶活隨著Fe2+濃度的增大而減小，當Fe2+濃度達到14 mg·L-1時均低于對照組。由此可見，Fe2+在P.c.菌生長及產MnP方面具有很重要的作用。

2.6　Cu2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

改變產酶體系的Cu2+濃度分別為0 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.6 mg·L-1、0.7 mg·L-1，測定產酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結果見圖6。

圖6　Cu2+濃度對P.c.菌生長及產MnP酶活的影響

由圖6可知，隨Cu2+濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均增大；在濃度為0.2 mg·L-1時，菌生物量及MnP酶活均達到最大，分別為0.0546 g和701.48 U·L-1，說明低濃度Cu2+可以顯著促進P.c.菌的生長及MnP酶活；而當Cu2+濃度超過0.2 mg·L-1后，菌生物量及MnP酶活呈明顯下降趨勢；當Cu2+濃度達到0.4 mg·L-1時，菌生物量及產MnP酶活已經低于對照組，說明該濃度下Cu2+已對菌的生長及產MnP酶活產生了顯著的抑制作用。這可能是由于Cu2+的重金屬作用引起的。重金屬離子會對微生物起毒害作用，可使蛋白質變性，且毒害作用在重金屬離子濃度較高時尤為明顯，所以Cu2+濃度越高，毒害作用越嚴重，使酶幾乎失活[14]。

3　結論

(1)藜蘆醇、苯甲醇和吐溫80的添加有利于白腐真菌的生長及產MnP：藜蘆醇在濃度為150 mg·L-1、苯甲醇在濃度為150 mg·L-1、吐溫80在濃度為14 mg·L-1時對MnP酶活的促進作用最好。

(2)Ca2+、Fe2+對白腐真菌的生長及MnP酶活的影響是一致的，表現為“先促進，后抑制”的作用。

(3) Cu2+對白腐真菌的生長及MnP酶活的抑制作用較明顯，僅在濃度小于0.4 mg·L-1時略微促進酶活，大于該濃度均表現為抑制作用。

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