王 琰，王志強(qiáng)，柴三明，倪亞莉，安錦霞，馮 帆

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

早期補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射在可疑受精障礙患者中的應(yīng)用

王 琰，王志強(qiáng)，柴三明，倪亞莉，安錦霞，馮 帆

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

目的 對(duì)體外受精—胚胎移植（IVF-ET）治療周期中可疑受精障礙患者采用早期補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）和部分卵母細(xì)胞單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射（Half-ICSI）進(jìn)行授精，比較兩種不同授精方式的臨床應(yīng)用效果。方法 回顧性分析2013年1—12月在我院進(jìn)行IVF-ET治療的患者，對(duì)可疑受精障礙者采用早期補(bǔ)救性ICSI和Half-ICSI授精，比較兩種授精方式受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率及臨床妊娠率，探討兩種授精方式在可疑受精障礙患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果 早期補(bǔ)救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯較Half-ICSI組高，差異有顯著性（P＜0.05）；而兩組在卵裂率、正常卵裂率、胚胎種植率以及臨床妊娠率之間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。早期補(bǔ)救性ICSI組臨床妊娠率較Half-ICSI組高4.11%。結(jié)論 IVF-ET常規(guī)授精失敗后行早期補(bǔ)救性ICSI可明顯提高受精率，是可疑受精障礙患者的最佳授精方式。

早期補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射；可疑受精障礙；體外受精-胚胎移植；妊娠率

據(jù)報(bào)道，在體外受精—胚胎移植（IVF-ET）周期中，由于不孕患者本身以及臨床刺激方案等原因，低受精或不受精的發(fā)生率為10%～20%[1]。有研究表明，在IVF-ET常規(guī)授精18～20 h后實(shí)施補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）可明顯提高受精率，但卻很難獲得高質(zhì)量的可利用胚胎而不能使臨床結(jié)局獲得有效改善[2]。隨著對(duì)卵子微觀結(jié)構(gòu)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)卵子在加精后2～4 h內(nèi)即可完成受精，受精后6 h，大部分受精卵會(huì)排出第二極體，從而方便觀察卵子的受精情況，有利于對(duì)卵子是否受精做出較明確的判斷而及早實(shí)施補(bǔ)救性ICSI[3，4]。雖然補(bǔ)救時(shí)ICSI可以有效解決卵母細(xì)胞不能正常受精的問(wèn)題，但卻存在一些潛在的治療風(fēng)險(xiǎn)[5，6]，因此，應(yīng)該嚴(yán)格把握ICSI的適應(yīng)證，為可疑受精障礙患者實(shí)施效果最佳、風(fēng)險(xiǎn)最小的體外授精方式。目前，對(duì)可疑受精障礙患者常用的授精方式有早期補(bǔ)救性ICSI和部分卵母細(xì)胞單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射（Half-ICSI）兩種，本研究通過(guò)回顧性分析本中心接受兩種不同授精方式患者的相關(guān)資料，旨在尋找針對(duì)可疑受精障礙患者的最佳授精方式。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2013年1—12月在我院接受IVF-ET治療的，因可疑受精障礙而實(shí)施早期補(bǔ)救性ICSI或Half-ICSI并在同周期進(jìn)行移植的患者101例，其中早期補(bǔ)救性ICSI組66例，Half-ICSI組35例。兩組患者均為原發(fā)性不孕，年齡＜35歲；女方至少一側(cè)輸卵管通暢；男方弱精癥但精液質(zhì)量未達(dá)ICSI指征。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超排卵方案 所有患者均采用我院常規(guī)小針長(zhǎng)方案促排卵[7]，即在前次月經(jīng)黃體中期開(kāi)始皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-a，0.1 mg/支，Ipsen），達(dá)降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予重組卵泡刺激素（Gona-F，445 IU/支，Serono）或國(guó)產(chǎn)卵泡刺激素（麗申寶，75 IU/支，珠海麗珠藥業(yè)）150～300 IU/d直到HCG日。當(dāng)出現(xiàn)至少3個(gè)直徑大于18 mm的卵泡后于當(dāng)晚21時(shí)肌注HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵。

1.2.2 精液處理 取卵當(dāng)日上午，男方采用手淫法將精液留取于一次性無(wú)菌精杯中，靜置于熱臺(tái)待液化后采用密度梯度離心法優(yōu)選精子，處理完畢后將優(yōu)選的精子沉淀輕輕加入已裝有平衡培養(yǎng)液的試管下層并置于CO2培養(yǎng)箱中使其再次上游，授精時(shí)取培養(yǎng)液上層精子。

1.2.3 授精方法及受精評(píng)估 早期補(bǔ)救性ICSI組：于注射HCG后38～40 h內(nèi)微滴授精，精子密度為2.8～3.0萬(wàn)條精子/卵，加精后4 h觀察受精情況，若雙極體（2Pb）卵母細(xì)胞所占比例不足成熟卵子的50%，則繼續(xù)培養(yǎng)至6 h，仍不足50%則對(duì)0Pb和1Pb卵母細(xì)胞實(shí)施補(bǔ)救性ICSI。Half-ICSI組：將一半的卵母細(xì)胞以80 U/ml透明質(zhì)酸酶（Sage）拆除顆粒細(xì)胞后直接實(shí)施ICSI，剩余卵子常規(guī)IVF-ET授精。

16～18 h后評(píng)估卵母細(xì)胞受精情況，觀察到雙原核（2PN）為正常受精。

40 h、64 h后觀察胚胎分裂情況，根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小是否均勻以及碎片數(shù)目評(píng)定胚胎等級(jí)，3d齡胚胎卵裂球數(shù)目≥7、碎片≤20%為優(yōu)質(zhì)胚胎；卵裂球數(shù)目≥5，碎片≤30%為可利用胚胎。根據(jù)患者自身情況每周期選擇2～3個(gè)胚胎進(jìn)行移植。

1.2.4 臨床妊娠判定 胚胎移植后14 d血HCG陽(yáng)性者為生化妊娠，5周后B超觀察到妊娠囊和胚胎原始心管搏動(dòng)者為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05，差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

早期補(bǔ)救性ICSI組和Half-ICSI組在年齡、不孕年限、病因、Gn總量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、基礎(chǔ)FSH以及移植日子宮內(nèi)膜厚度間差異均無(wú)顯著性（P＞0.05），具有可比性（見(jiàn)表1）。

表1 早期補(bǔ)救性ICSI組和Half-ICSI組一般情況比較（±s）

表1 早期補(bǔ)救性ICSI組和Half-ICSI組一般情況比較（±s）

組別 年齡（歲）不孕年限（年）Gn總量（支）獲卵數(shù)（n）MⅡ卵數(shù)（n）基礎(chǔ)FSH（IU/L）內(nèi)膜厚度（mm）早期補(bǔ)救性ICSI組Half-ICSI組P 30.94±4.96 31.08±5.19＞0.05 5.98±2.60 6.42±4.01＞0.05 27.65±7.79 29.08±11.22＞0.05 10.82±4.88 9.66±5.22＞0.05 9.79±4.66 9.42±4.60＞0.05 6.56±1.51 6.81±1.29＞0.05 11.07±2.26 11.55±2.09＞0.05

2.2 兩種授精方式實(shí)驗(yàn)室及臨床資料比較

與Half-ICSI組相比，早期補(bǔ)救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）；而兩組在卵裂率、正常卵裂率、種植率之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。早期補(bǔ)救性ICSI組臨床妊娠率較Half-ICSI組高，但差異無(wú)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)表2。本次研究結(jié)果顯示，Half-ICSI組受精率和正常受精率明顯偏低，因此對(duì)所選對(duì)象進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Half-ICSI組中，有26例患者卵子采用IVF-ET常規(guī)授精后完全不能受精，9例患者常規(guī)IVF-ET后有僅部分卵子受精。

表2 早期補(bǔ)救性ICSI組和Half-ICSI組實(shí)驗(yàn)室及臨床各指標(biāo)比較（%）

3 討論

受精障礙是影響IVF-ET的重要因素之一，引起受精障礙的因素很多，主要包括卵子成熟不良、精卵結(jié)合異常、卵母細(xì)胞不能正常激活等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)常規(guī)IVF-ET治療中，卵母細(xì)胞受精率為60%～70%，低受精或完全不受精占整個(gè)IVF-ET周期的10%～20%[1，8]。因此，如何提高可疑受精障礙患者卵母細(xì)胞受精率及利用率，是目前IVF-ET技術(shù)發(fā)展的焦點(diǎn)問(wèn)題。

傳統(tǒng)的IVF-ET技術(shù)是在精卵結(jié)合后16～22 h脫去顆粒細(xì)胞，依受精情況決定是否進(jìn)行補(bǔ)救性ICSI，但此種方法獲得的可利用胚胎和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)較少，胚胎質(zhì)量較差，很難得到理想的臨床妊娠率及分娩率[9]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞若能正常受精，則有大約90%的受精卵在加精后6 h排出第二極體[10]，據(jù)此，人們提出采用早期補(bǔ)救性ICSI來(lái)防止低受精或不受精。Half-ICSI授精時(shí)，由于一半受精卵被直接實(shí)施ICSI授精，另一半采用常規(guī)IVF-ET受精，若卵母細(xì)胞受精能力正常，則部分受精卵由于被實(shí)施ICSI操作而加大了治療風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也增加了患者的治療費(fèi)用；若卵母細(xì)胞受精能力低下或完全不能受精時(shí)，由于部分卵母細(xì)胞被實(shí)施常規(guī)受精而大大降低受精率，從而影響IVF-ET治療周期的卵母細(xì)胞利用率。早期補(bǔ)救性ICSI采用早加精I(xiàn)VF，6 h后對(duì)未受精卵母細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)救性ICSI，從而避免出現(xiàn)過(guò)多卵母細(xì)胞不受精的情況，提高了IVF-ET治療周期的受精率，同時(shí)，能夠有效降低過(guò)度使用ICSI操作帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。本次研究發(fā)現(xiàn)，Half-ICSI組中，卵母細(xì)胞受精率超過(guò)70%的周期數(shù)為9例，占總Half-ICSI周期數(shù)的25.7%，表明這些患者卵母細(xì)胞受精能力正常卻在IVF-ET治療中由于采用Half-ICSI進(jìn)行受精而被過(guò)度實(shí)施ICSI操作，增加了治療風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，通過(guò)比較兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，早期補(bǔ)救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率均較Half-ICSI組高，表明早期補(bǔ)救性ICSI可明顯提高可疑受精障礙患者的卵母細(xì)胞利用率，從而增加患者的移植和妊娠機(jī)會(huì)，這與吳麗敏等[11]的研究結(jié)果相符。

另有文獻(xiàn)報(bào)道[12，13]，在體外受精精卵共培養(yǎng)時(shí)，高密度精子所產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物以及卵周顆粒細(xì)胞合成和釋放的各種細(xì)胞因子均可對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，從而直接影響胚胎的后續(xù)發(fā)育、分裂以及種植，降低臨床妊娠率。采用Half-ICSI授精時(shí)，部分卵母細(xì)胞需要在未拆除顆粒細(xì)胞的狀態(tài)下與精子過(guò)夜共培養(yǎng)，使得這部分卵母細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間遭受各種顆粒細(xì)胞釋放因子和精子代謝產(chǎn)物以及活性氧的侵蝕，從而降低了胚胎的后續(xù)發(fā)育能力，另一部分卵母細(xì)胞由于被直接實(shí)施ICSI操作而處于高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)。早期補(bǔ)救性ICSI后，需在較短的時(shí)間內(nèi)拆除顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞的受精情況并將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，如此則有效避免了卵母細(xì)胞或受精卵長(zhǎng)時(shí)間承受精子和顆粒細(xì)胞的間接損傷，在很大程度上保護(hù)受精卵的后續(xù)發(fā)育能力。然而，與預(yù)期結(jié)果不同的是，本次研究數(shù)據(jù)顯示，早期補(bǔ)救性ICSI臨床妊娠率較Half-ICSI高4.11%，但卻無(wú)顯著性差異，這可能是由于每位患者在當(dāng)次周期內(nèi)僅移植2～3個(gè)胚胎，從而無(wú)法觀察兩種方法對(duì)患者最終妊娠結(jié)局的影響造成的。因此，要說(shuō)明兩種不同授精方法對(duì)臨床妊娠率的影響，應(yīng)對(duì)二者累積妊娠率進(jìn)行比較，但本次所選部分對(duì)象在首次移植未獲妊娠后未進(jìn)行冷凍胚胎移植，因此，暫不討論兩種授精方法對(duì)IVF-ET最終結(jié)局的影響。

綜上所述，雖然早期補(bǔ)救性ICSI與Half-ICSI均能提高低受精和不受精卵母細(xì)胞的受精率，但綜合各因素評(píng)價(jià)，早期補(bǔ)救性ICSI在提高受精率、增加卵母細(xì)胞利用率以及改善患者治療結(jié)局方面更優(yōu)于Half-ICSI，是可疑受精障礙患者進(jìn)行IVF-ET治療的首選授精方式。

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