李聰 顧健 敖華飛 阮清偉 孔德秋

·基礎(chǔ)研究·

石杉?jí)A甲對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)老年性聾神經(jīng)纖維的保護(hù)作用

李聰 顧健 敖華飛 阮清偉＊孔德秋

目的 研究石杉?jí)A甲(Hup A)對(duì)D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)的老年性聾大鼠耳蝸神經(jīng)纖維的保護(hù)作用。方法 3～4周Sprague-Dawley雄性大鼠30只，隨機(jī)平均分為3組，模型組用5%D-gal(200 mg/kg)行頸背部皮下注射制備老年性聾模型，D-gal+Hup A組為大鼠頸背部皮下注射同體積5% D-gal(200 mg/kg)和Hup A(0.1 mg/kg)，對(duì)照組予同體積生理鹽水作頸背部皮下注射，均連續(xù)注射8周。β-半乳糖苷酶染色耳蝸衰老細(xì)胞；同時(shí)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組用藥后神經(jīng)纖維數(shù)目的變化。結(jié)果 模型組耳蝸衰老細(xì)胞密度最高，D-gal+Hup A組和對(duì)照組卻差別不大。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析，D-gal+Hup A組神經(jīng)纖維的數(shù)目和對(duì)照組無(wú)明顯差異，而模型組神經(jīng)纖維數(shù)目明顯少于D-gal+Hup A組(P<0.05)。結(jié)論 Hup A對(duì)D-gal誘導(dǎo)的老年性聾的神經(jīng)纖維具有保護(hù)作用。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2014，14：177-180)

石杉?jí)A甲；D-半乳糖；老年性聾；神經(jīng)纖維；保護(hù)作用

老年性聾又稱年齡相關(guān)性聽(tīng)力下降，主要指隨著年齡的增加，在排除噪聲、耳毒性藥物和遺傳因素的情況下，聽(tīng)覺(jué)器官隨同身體其他組織器官一起發(fā)生的老化過(guò)程。主要表現(xiàn)為雙耳漸進(jìn)性、對(duì)稱性的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，以高頻聽(tīng)力下降為主，伴言語(yǔ)識(shí)別率降低等[1]。但迄今為止，老年性聾的防治仍然是尚未解決的難題。石杉?jí)A甲(Huperzine A, Hup A)素有“植物中的黃金”之稱，已經(jīng)在臨床上用于治療阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病[2-3]。本實(shí)驗(yàn)組擬通過(guò)注射D-半乳糖(D-galactose,D-gal)模擬機(jī)體衰老機(jī)制制備老年性聾模型，觀察石杉?jí)A甲是否具有保護(hù)耳蝸神經(jīng)纖維的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague -Dawley(SD)雄性大鼠(3～4周)30只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(滬)2009—0019。耳廓反射靈敏，動(dòng)物均無(wú)強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Hup A(商品名：雙益平)購(gòu)于上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司(批號(hào)：090504)，D-gal購(gòu)于美國(guó)Santa公司，神經(jīng)纖維200(neurofilament 200, NF200)抗體購(gòu)于Abcam公司，衰老特異性β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 所選的SD大鼠在清潔安靜的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)平均分為以下3組。

1)模型組：用5%D-gal(200 mg/kg)進(jìn)行頸背部皮下注射，連續(xù)8周。

2)D-gal+Hup A組：用5%D-gal(200 mg/kg)和Hup A(0.1 mg/kg)配成與模型組同體積溶液行頸背部皮下注射，連續(xù)8周。

3)對(duì)照組：SD大鼠10只，予以同體積生理鹽水行頸背部皮下連續(xù)注射8周。

1.2.2 組織準(zhǔn)備 上述模型制備后將各組的SD大鼠經(jīng)戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，開(kāi)胸后用4%多聚甲醛行心臟灌注。迅速斷頭，取出耳蝸，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃過(guò)夜。常規(guī)行10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣2周。后行梯度脫水，先浸入15%蔗糖溶液，再浸入30%蔗糖溶液，至組織塊下沉。所有組織塊均在液氮中保存，在-20 ℃的恒冷切片機(jī)上以5 μm厚連續(xù)冠狀切片，制作冷凍切片。

1.2.3 衰老特異性β-半乳糖苷酶染色衰老細(xì)胞 取各組SD大鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)冷凍切片，置于適當(dāng)體積的β-半乳糖苷酶染色固定液中，室溫固定15 min。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)浸泡洗滌組織3次，每次不少于5 min；吸除PBS，加入適量染色工作液；按細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒配置，37 ℃孵育過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光染色 取各組SD大鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)冷凍切片于室溫下30 min，置入4%丙酮固定10 min，0.01 mmol/L PBS漂洗5 min，共3次；用3%過(guò)氧化氫孵育5 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；再用0.01 mmol/L PBS漂洗5 min，共3次；小牛血清封閉非特異性抗原1 h，滴加NF200抗體(1∶1 000)；加四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)山羊抗兔免疫球蛋白G，室溫孵育30 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次， 3 min/次；苯基吲哚封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-半乳糖苷酶染色衰老細(xì)胞 如圖1所示，耳蝸組織中，老年性聾模型組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞密度比對(duì)照組明顯增高，而D-gal+Hup A組和對(duì)照組的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞密度差別不大。

圖1. β-半乳糖苷酶染色衰老細(xì)胞(圖中藍(lán)色即為衰老的螺旋

2.2 神經(jīng)纖維的免疫熒光染色 3組SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)纖維的免疫熒光結(jié)果見(jiàn)圖2。為進(jìn)一步量化神經(jīng)纖維的數(shù)目，進(jìn)行了記數(shù)。由染色照片和統(tǒng)計(jì)圖可知：與對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)纖維的數(shù)目明顯減少，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而D-gal+Hup A組的神經(jīng)纖維數(shù)目無(wú)明顯減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和D-gal+Hup A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

老年性聾是人體老化過(guò)程在聽(tīng)覺(jué)器官中的表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今還沒(méi)有統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制理論[4]。近年來(lái)最重要的進(jìn)展是認(rèn)同氧化應(yīng)激，其中線粒體老化計(jì)時(shí)假說(shuō)[5]最引人矚目。該理論認(rèn)為，線粒體氧利用率高，是活性氧的主要亞細(xì)胞來(lái)源。當(dāng)活性氧的產(chǎn)生和清除之間失去平衡，就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激?；钚匝鯇?duì)生物大分子具有很強(qiáng)的破壞作用，可導(dǎo)致線粒體DNA、細(xì)胞等的廣泛損傷，內(nèi)源性抗氧化酶減少，線粒體膜穩(wěn)定性破壞，向細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，設(shè)法減少機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生， 改善抗氧化防御和氧化損傷的修復(fù)功能，將大大提高老年性聾的防治水平。

圖2. 神經(jīng)纖維免疫熒光染色和記數(shù)(紅色為NF200抗體染的神經(jīng)纖維，藍(lán)色為DAPI染的細(xì)胞核；×400)

目前應(yīng)用大鼠、小鼠等動(dòng)物構(gòu)建的衰老動(dòng)物模型主要有：D-gal致衰老動(dòng)物模型[6]、SAMP系小鼠衰老模型、去胸腺衰老模型、自然衰老模型等。與其他衰老動(dòng)物模型相比，D-gal致衰老模型因其造模方法簡(jiǎn)便易行、成本低廉、結(jié)果穩(wěn)定及造模周期相對(duì)較短等優(yōu)點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型。Chen等[7]近年來(lái)利用頸背部皮下連續(xù)注射D-gal建立了大鼠內(nèi)耳和聽(tīng)覺(jué)中樞擬老化的動(dòng)物模型，該模型動(dòng)物表現(xiàn)出一系列與自然老化動(dòng)物相似的行為和生化指標(biāo)。故在本實(shí)驗(yàn)中我們采用了此模型。

目前普遍認(rèn)為D-gal誘導(dǎo)衰老的假設(shè)機(jī)制[8]有以下幾個(gè)方面：大劑量的D-gal在體內(nèi)不能完全被代謝為葡萄糖利用，剩余的在肝臟中生成半乳糖醛醇和H2O2，半乳糖醛醇不被代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、脆性增加，致使細(xì)胞損傷；H2O2的大量生成導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激增加，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基的增加，最終引起細(xì)胞老化。本實(shí)驗(yàn)的模型組結(jié)果顯示，細(xì)胞老化和神經(jīng)數(shù)目的減少，正好印證D-gal成功致衰老模型。

Hup A是從草藥蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體。大量研究顯示，Hup A通過(guò)抗凋亡、抗氧化、減弱谷氨酸介導(dǎo)的興奮性細(xì)胞毒性等多靶點(diǎn)作用起到神經(jīng)保護(hù)作用。又因其具有易透過(guò)血-腦屏障、口服生物利用度好，且持續(xù)作用時(shí)間更長(zhǎng)和外周不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，目前已在臨床上用于阿爾茲海默病、重癥肌無(wú)力、精神分裂癥以及其他神經(jīng)退行性疾病的治療。故本實(shí)驗(yàn)利用Hup A的此優(yōu)點(diǎn)研究其對(duì)老年性聾的耳蝸神經(jīng)纖維是否具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用了直觀觀察細(xì)胞衰老的方法。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒是一種基于衰老時(shí)β-半乳糖苷酶活性水平上調(diào)而對(duì)衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測(cè)的試劑盒。衰老細(xì)胞不能在一些常規(guī)的刺激下再誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，并且細(xì)胞周期分布也比較特殊，不同于細(xì)胞凋亡時(shí)抑制的情況。在普通光學(xué)顯微鏡下，該衰老特異性試劑僅在衰老細(xì)胞中變成藍(lán)色，進(jìn)而直觀觀測(cè)到細(xì)胞或組織的衰老情況。光學(xué)顯微鏡下觀察到模型組衰老細(xì)胞密度明顯高于D-gal+Hup A組和對(duì)照組，說(shuō)明造模成功。組間對(duì)比間接說(shuō)明：Hup A抑制了D-gal引起的細(xì)胞衰老。此方法直觀、簡(jiǎn)潔地觀察了耳蝸中衰老的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但是存在不精確的缺點(diǎn)，所以我們進(jìn)一步做了免疫熒光染色，兩者的結(jié)果是一致的。

在前期的實(shí)驗(yàn)[9]中，我們已經(jīng)通過(guò)檢測(cè)聽(tīng)性腦干反應(yīng)對(duì)各組大鼠各波潛伏期的變化進(jìn)行了觀察，D-gal+Hup A組聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值出現(xiàn)Ⅲ波潛伏期、Ⅰ-Ⅴ波間期縮短，聽(tīng)覺(jué)通路上神經(jīng)傳導(dǎo)加快，表明Hup A可以提高中樞對(duì)聲音的加工過(guò)程，進(jìn)而推斷這可能與改變軸突脫髓鞘變有關(guān)。NF是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，特異性分布于神經(jīng)元的胞體及突起內(nèi)[10]。NF根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同可分為NF68、NF160和NF200 3種，其中NF200在正常情況下只存于軸索中。所以通過(guò)加入NF200抗體，進(jìn)行免疫熒光染色，計(jì)數(shù)神經(jīng)纖維的數(shù)目；同時(shí)為了標(biāo)注細(xì)胞，使用了苯基吲哚進(jìn)行細(xì)胞核免疫染色。為了不出現(xiàn)重復(fù)計(jì)數(shù)，兩者疊加處不在神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。經(jīng)過(guò)對(duì)比，很容易看出：與對(duì)照組比，模型組的神經(jīng)纖維數(shù)目明顯減少；而D-gal+Hup A組神經(jīng)纖維數(shù)目則減少不明顯。模型組和D-gal+Hup A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明：Hup A對(duì)D-gal致衰老的動(dòng)物神經(jīng)纖維具有保護(hù)作用，可以延緩神經(jīng)纖維數(shù)目的減少，具有延緩衰老的作用。

因此，Hup A對(duì)耳蝸神經(jīng)纖維的保護(hù)作用將有益于老年性聾的臨床治療，然而這一結(jié)論還有待于進(jìn)一步的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。

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(本文編輯 楊美琴)

試題5.答案：C。視神經(jīng)炎是常見(jiàn)的視神經(jīng)疾病，其典型的表現(xiàn)為：好發(fā)于年輕女性，單眼發(fā)病，起病急，視力下降，伴有球后或眼球轉(zhuǎn)動(dòng)痛。視力常在病后1周降到最低。眼底視盤充血，邊界模糊，視盤可有極少量條狀出血，視網(wǎng)膜正常。視神經(jīng)炎的病程不論治療與否，病后2周開(kāi)始視力逐漸好轉(zhuǎn)，1個(gè)月后?；謴?fù)到病前或略降低；無(wú)論視力恢復(fù)多少，1～2個(gè)月后視盤出現(xiàn)萎縮，萎縮僅限顳側(cè)或者囊括全部。

試題6.答案：B。隨著影像技術(shù)的發(fā)展，OCT在神經(jīng)眼科的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。盡管多種疾病都造成RNFL變薄，但變薄的模式并不相同。有研究發(fā)現(xiàn)在線粒體視神經(jīng)病變的晚期，14484型突變患者的RNFL厚度顯著大于11778型突變患者的RNFL厚度，這可能是11778型突變比14484型突變視力預(yù)后更差的原因。

試題7.答案：A。Brown綜合征表現(xiàn)為眼內(nèi)收時(shí)上轉(zhuǎn)障礙，絕大多數(shù)為單眼發(fā)病。黃色瘤為雙眼發(fā)病，好發(fā)于近內(nèi)眥部皮膚。視網(wǎng)膜格子樣變性為雙眼發(fā)病，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜變薄區(qū)域呈梭形，伴有交叉網(wǎng)格樣白線。瘢痕性早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變?yōu)殡p眼發(fā)病，表現(xiàn)為顳側(cè)眼底周邊色素沉著及纖維化。

Protective effect of Huperzine A on nerve fibers of presbycusis rats induced byD-galactose

LICong,GUJian,AOHua-fei,RUANQing-wei＊,KONGDe-qiu.

DepartmentofOtorhinolaryngology,NO.3People’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China

AO Hua-fei, Email:david5882004@126.com

Objective To investigate the protective effect of Huperzine A (Hup A) on the nerve fibers of presbycusis induced byD-galactose (D-gal). Methods A total of 30 Sprague -Dawley male rats were used in the study. Rats were divided into three groups. ①D-gal group (model group): rats were daily subcutaneously injected with 200 mg/kgD-gal for 8 weeks; ②D-gal+Hup A group: rats were received bothD-gal (200 mg/kg)and Hup A (0.1 mg/kg)in the same way; ③Control group: rats were given the same volume of vehicle. β-galactosidase was used to stain senescent cells in the cochlea and immunohistochemistry was used to detect the number of nerve fibers after treatment. Results Model group had the highest density of senescent cells in the cochlea, but no difference was seen between theD-gal+HupA group and the control group. There was statistically significant difference in the number of nerve fibers between the model and theD-gal+Hup A group (P<0.05), but none was seen between theD-gal+Hup A group and the control group. Conclusions Hup A exhibits protective effect on the nerve fibers of presbycusis induced byD-gal. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:177-180)

Huperzine A;D-galactose; Presbycusis; Nerve fibers; Protective effects

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 上海 201900；＊復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 上海 200040

敖華飛(Email：david5882004@126.com)

2013-08-19)