許軍 葉小磊 陳淑飛 鄭周數(shù) 邵小飛 蘇仁杰 張磊 曾云 史波寧

·臨床研究·

先天性非綜合征性耳聾患者100例常見耳聾基因分析△

許軍 葉小磊＊陳淑飛＊＊鄭周數(shù)＊＊邵小飛＊＊蘇仁杰＊＊張磊＊＊＊曾云＊＊＊史波寧＊＊

目的 應(yīng)用耳聾基因芯片對先天性非綜合征性耳聾(NSHI)患者進(jìn)行基因篩查。方法 采集寧波市兒童聽力篩查診斷中心確診的100例先天性NSHI患者的外周血，提取DNA。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜多態(tài)性分型技術(shù)檢測縫隙連接蛋白β2(GJB2)、GJB3、SLC26A4、線粒體DNA (mtDNA)、12S rRNA熱點突變位點。結(jié)果 共檢出GJB2基因突變22例(22%)、SLC26A4基因突變12例(12%)；未檢出GJB3基因和線粒體12S rRNA突變。結(jié)論 本組耳聾人群中與篩查位點有關(guān)的耳聾比例高達(dá)34%，該人群遺傳性聾GJB2突變的發(fā)生率最高，SLC26A4突變的發(fā)生率次之。(中國眼耳鼻喉科雜志，2014，14：184-186)

耳聾； 基因診斷； 縫隙連接蛋白β2； SLC26A4

耳聾是最常見的感覺障礙性疾病，我國聽力言語殘疾人口已達(dá)到2 000余萬，居各種殘疾之首。新生兒極重度聾的發(fā)病率為0.1%～0.3%[1]。耳聾病因復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，約60%的先天性耳聾與遺傳因素有關(guān)[1-2]。世界上迄今已經(jīng)確定與非綜合征性耳聾(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)有關(guān)的常染色體致病基因超過64個，突變位點125個[3]，近來還不斷有新發(fā)現(xiàn)。這些都是目前開展遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷以及將來基因治療的依據(jù)。先天性耳聾基因組織庫是進(jìn)行耳聾相關(guān)基因診斷的基礎(chǔ)工作和必備條件，是對先天性耳聾進(jìn)行基因診斷，基因保存，臨床資料采集、保存及統(tǒng)計的平臺。

1 資料與方法

1.1 資料 統(tǒng)計來自于寧波市兒童聽力篩查診斷中心確診的先天性NSHI患者，且已收存于本院耳聾基因組織庫中的資料。其中男性61例、女性39例；年齡3個月～10歲，平均3.6歲。100例患者中，順產(chǎn)73例、剖宮產(chǎn)27例；有聽力高危因素者共33例，其中早產(chǎn)6例，母親孕期患風(fēng)疹3例、麻疹2例、腎盂腎炎1例、感冒發(fā)熱用藥(具體用藥不詳)18例，祖輩中近親結(jié)婚1例，家族中有聾啞患者1例，母親因慶大霉素致聾1例。

1.2 方法

1.2.1 病史采集 采用問卷調(diào)查形式，填寫患者基本信息及耳聾史、家族史、高危因素等。本研究的臨床信息和血樣采集均獲得了患者監(jiān)護(hù)人的同意，并簽署了知情同意書。

1.2.2 聽力學(xué)診斷 聽力學(xué)檢查包括聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)、聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)(auditory steady state response，ASSR)、聲導(dǎo)抗、純音測聽(僅對較大年齡且能配合者施行)。儀器采用美國GSI 70聽力篩查儀及美國智聽腦干誘發(fā)電位測試系統(tǒng)。每例患者均行耳鼻咽喉科常規(guī)檢查，在排除外耳、中耳、內(nèi)耳疾病及噪聲性聾的情況下，聽力損害以ABR閾值>30 dB nHL為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 基因檢測方法 采集患者靜脈血8 mL，取0.5 mL制作干燥血片，送華大基因深圳華大臨床檢驗中心，使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS)多態(tài)性分型技術(shù)，針對縫隙連接蛋白β2(gap junction protein beta-2，GJB2)、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA等4個常見耳聾相關(guān)基因中的20個中國人突變熱點進(jìn)行檢測[4-5]。其余血液應(yīng)用全血基因組D.A提取試劑盒提取基因組D.A。微量紫外分光光度計進(jìn)行定量和純度檢測，瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀照射條件下觀察帶紋，確認(rèn)基因組D.A 質(zhì)量。分裝工作液、標(biāo)記，置于-80 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 資料整理及保存 將知情同意書、問卷調(diào)查表、聽力檢查結(jié)果、繪制的家系圖譜、血液樣本、基因組D.A樣品輸入計算機，建立唯一流水號的Excel文件，實現(xiàn)檔案的數(shù)據(jù)化管理，可以隨時查看、調(diào)用。同時，建立與電子版相對應(yīng)的紙質(zhì)檔案。以上各資料均以相應(yīng)的代碼保存，保證所有資料一一對應(yīng)，并由專門人員負(fù)責(zé)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)化管理。

2 結(jié)果

根據(jù)病史和聽力學(xué)檢測結(jié)果，調(diào)查對象均被診斷為先天性聾，其中雙側(cè)耳聾93例、單側(cè)耳聾7例；輕中度聽力損失45耳、重度及重度以上聽力損失148耳。

100例患者基因檢測結(jié)果見表1。其中檢測出GJB2基因致病突變22例，3例患者同時有2個基因檢測位點突變,1例為176～191del 16合并235del C，2例為299～300del AT合并235del C；SLC26A4基因致病突變12例，均由CT及磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)掃描證實為大前庭導(dǎo)水管綜合征(large vestibular aqueduct syndrome,LVAS)，其中2例患者同時有2個基因檢測位點突變，1例為IVS15+5G→A合并1174A→T，1例為1975G→C合并2168A→G。所有檢測陽性病例均為雙側(cè)耳聾。

GJB2基因突變病例聽力損失包括中重度以下12例、重度及以上10例；SLC26A4基因突變病例的聽力損失包括中重度以下6例、重度及以上6例。經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.064,P=0.800>0.05)。

表1 100例耳聾患者4個基因20個位點檢測結(jié)果(n)

3 討論

遺傳性耳聾致病基因診斷的傳統(tǒng)方法主要有酶切法和直接測序，耗時費力、成本較高，且難以同時檢測多個基因的不同突變位點。MALDI-TOFMS作為一種高通量的單核苷酸多態(tài)性分型技術(shù)受到關(guān)注，該技術(shù)利用過量的低相對分子質(zhì)量有機酸作為基質(zhì)吸收激光能量, 再將能量傳給被分析的樣本, 基質(zhì)-樣本之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣本氣化、離子化, 從而形成單個負(fù)離子或正離子；離子在電場作用下, 飛過自由漂移區(qū)到達(dá)質(zhì)譜儀,根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，即質(zhì)譜儀根據(jù)樣本的質(zhì)荷比(m/z)檢測離子，并測得樣品的相對分子質(zhì)量[6]。該技術(shù)的特點是，一次可以讀取分析最多幾百萬條DNA序列，相對成本較低，節(jié)省時間，具有快速、高準(zhǔn)確性、高通量、高度并行性等優(yōu)點，因此成為臨床上耳聾基因檢測的重要手段。運用此項技術(shù)一次可檢測涉及耳聾的20個位點。

對于最常見的GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾，絕大多數(shù)表現(xiàn)為先天性重度感音神經(jīng)性聾，屬于NSHI。在不同種族和地域的NSHI患者中，GJB2基因的突變頻率和熱點突變明顯不同。在歐美的高加索人種中，35delG占所有突變的58%～88% ，北歐的猶太人種中167delT為主要突變，占40%；在日本和韓國，235delC為GJB2基因的主要突變[7]。陳俞等[8]發(fā)現(xiàn)，235delC是漢族、維吾爾族、回族耳聾患者的熱點突變；郭玉芬等[9]報道的801例中國西北地區(qū)NSHI患者中，GJB2基因的突變占15.61%(125/801)。本研究100例寧波地區(qū)NSHI患者中，235delC 占所有突變的80%(20/25)，其次為299～300delAT，占所有突變的16% (4/25)；而176～191del 16 僅占4% (1/25) ；35delG、167delT在本次研究中沒有被檢測到。Dai等[10]報道的2 063例NSHI患者中GJB2基因突變432例，本研究所得數(shù)據(jù)與之比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.621 2,P=0.276)，其報道中主要為235delC突變(345例)，與本組數(shù)據(jù)比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.064 6,P=0.799)。

GJB2的基因突變可能導(dǎo)致連接蛋白異常，進(jìn)而影響細(xì)胞間隙的連接功能。引起聽力損害的程度多與基因突變類型和位點有關(guān),其中235delC突變?yōu)榻財嘈屯蛔?多伴有極重度聾[11]。GJB2基因突變者一般不伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，耳蝸神經(jīng)、聽覺中樞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞基本正常。此類患兒接受人工耳蝸植入的聽力言語康復(fù)效果較好，可作為人工耳蝸手術(shù)前療效預(yù)測的一項基因檢測方法[12]。

LVAS又稱先天性前庭水管擴(kuò)大，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳, 但也可能存在小部分常染色體顯性遺傳或多分子遺傳,與SLC26A4基因突變有關(guān)[13]。目前已經(jīng)報道的SLC26A4基因突變位點超過170個[14], 其中絕大部分是錯義突變。另外還有框移突變和剪接位點突變, 可同時存在2個或2個以上的突變位點。LVAS是以前庭水管擴(kuò)大伴有嬰兒期或年幼時波動性、進(jìn)行性聽力損害為臨床特征的獨立病癥, 多表現(xiàn)為NSHI,聽力受損以高頻為主, 耳聾的程度與前庭水管的大小無關(guān)，診斷主要依靠顳骨CT和MRI掃描。常因上呼吸道感染發(fā)熱、頭部撞擊、劇烈運動及極度疲勞等，引起顱內(nèi)壓增高而導(dǎo)致耳聾的進(jìn)一步惡化。目前尚無確切有效的治療方法, 但應(yīng)預(yù)防聽力的驟然下降。部分患者出生時可以無明顯聽力障礙[15-16]，新生兒大規(guī)模的CT掃描在預(yù)防醫(yī)學(xué)中是難以實現(xiàn)的,并且家長多因?qū)Ψ派渚€的顧慮而放棄, 而快速簡便的基因檢測則有可能在嬰兒出生后就發(fā)現(xiàn)大部分此類患兒,從而采取嚴(yán)格的防護(hù)措施,以盡量保證患兒在言語形成期具備有效聽力。本組有LVAS患者14例，均為雙耳發(fā)病，其中12例檢測得SLC26A4基因的突變，占85.7%，1例檢測得GJB2基因235del C位點突變，1例檢測未見異常，但其母親孕期有感冒發(fā)熱用藥病史。提示除SLC26A4 基因外，可能還存在與LVAS 發(fā)病相關(guān)的其他基因或未知的SLC26A4 基因突變位點。

同樣的耳聾表型可能由不同的基因突變所致，而同一基因不同位點的突變也可能表現(xiàn)不同的表型，并且遺傳性聾可能源于多基因、多突變的累積效應(yīng)。由于受檢測基因數(shù)目所限，以及已知遺傳學(xué)知識的局限性，目前基因檢測為陰性者，并不表示沒有其他基因問題。先天性耳聾的遺傳學(xué)研究正在不斷深入，不斷有新的耳聾致病基因及其突變位點被發(fā)現(xiàn)，所以對先天性耳聾患者的D.A，以建立基因組織庫的形式保存，供長期研究非常必要。

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(本文編輯 楊美琴)

Deafness gene analysis of 100 patients with congenital nonsyndromic hearing impairment

XUJun,YEXiao-lei＊,CHENShu-fei＊＊,ZHENGZhou-shu＊＊,SHAOXiao-fei＊＊,SURen-jie＊＊,ZHANGLei＊＊＊,ZENGYun＊＊＊,SHIBo-ning＊＊.

DepartmentofOtorhinolaryngology,theaffiliatedHospitalofNingboUniversityMedicineCollege,Ningbo315020,China

SHI Bo-ning, Email:shibn@163.com

Objective To screen deafness gene in congenital nonsyndromic hearing impairment (NSHI) patients with Matrix-assisted laser desorption or ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Methods One hundred patients with congental nonsyndromic sensorineural hearing loss admitted to the children hearing screening and diagnostic center of Ningbo were enrolled in this study. Their peripheral blood samples were taken and tested using MALDI-TOF-MS. Hot mutation sites of four genes including gap junction protein beta-2 (GJB2), GJB3,SLA26A4 and mitochondrial 12S rRNA were detected. Results The positive rate of GJB2 was 22%(22 cases)and of SLA26A4 was 12%(12 cases). Cases with GJB3 or mitochondrial 12S rRNA mutation were not found. Conclusions In this study ,the total positive rate of four genes was 34%.The positive rate of GJB2 was the largest in four genes and SLA26A4 was the second. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:184-186)

Deafness; Genetic diagnosis; Gap junction protein beta-2; SLC26A4

2011年寧波市社會發(fā)展科研資助項目(2011C50036)

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 寧波 315020；＊浙江省寧波市分子診斷中心 寧波 315020；＊＊浙江省寧波市兒童聽力篩查 診斷中心 寧波市聽覺和平衡醫(yī)學(xué)重點實驗室 寧波 315020；＊＊＊廣東省深圳市華大臨床檢驗中心 深圳 518000

史波寧(Email：shibn@163.com)

2013-05-06)