仲偉天 綜述 王旭開 審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科，重慶 400042)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常伴有胰島素抵抗，胰島素抵抗首次由Himsworth 提出，是指機(jī)體對(duì)胰島素不敏感，從而影響血糖的代謝，這時(shí)機(jī)體為了維持一個(gè)較正常的血糖水平，通過(guò)自我調(diào)節(jié)機(jī)制使其胰島β 細(xì)胞分泌較正常多幾倍甚至十幾倍的胰島素來(lái)降低血糖，這便造成了高胰島素血癥。20世紀(jì)70 年代de Fronzo 等發(fā)展了葡萄糖胰島素鉗夾技術(shù)，此技術(shù)迄今仍為世界公認(rèn)在體內(nèi)定量而準(zhǔn)確測(cè)定胰島素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)方法，當(dāng)空腹或餐后胰島素峰值大于正常人均值+2 倍標(biāo)準(zhǔn)差(一般為空腹胰島素＞15 mU/L，或/及餐后＞80 mU/L)時(shí)，可診斷為高胰島素血癥［1］。

高胰島素血癥是冠心病、高血壓、高血脂、T2DM、肥胖、腦卒中等共同的發(fā)病基礎(chǔ)。目前越來(lái)越多的數(shù)據(jù)證實(shí)高胰島素血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素之一，主要機(jī)制是高胰島素血癥導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。世系追蹤研究提出確切證據(jù)，成年動(dòng)物的血管平滑肌細(xì)胞保持顯著的可塑性［2-3］，當(dāng)遭遇血管損傷、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或者疾病時(shí)可以進(jìn)行可逆的表型轉(zhuǎn)化［4-6］，由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成分泌表型。這種可塑性的危害在于其表型轉(zhuǎn)化受到環(huán)境因素的影響，有許多證據(jù)證實(shí)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換在多種疾病中至關(guān)重要，例如動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、高血壓等。

1 血管平滑肌細(xì)胞異常甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化

有研究證實(shí)表觀遺傳改變是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的重要原因之一，主要表現(xiàn)為CpG 島(CpG island)的DNA 甲基化和組蛋白的乙?；?。暴露于有害的環(huán)境或者有害的因子也許可以使導(dǎo)致內(nèi)膜功能損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的氧化劑和炎性基因的表觀遺傳改變。

表觀遺傳學(xué)通常被定義為DNA 的序列不發(fā)生改變但是基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，也就是說(shuō)基因型未改變而表型卻發(fā)生了改變，這種變化是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)的改變，并且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中能穩(wěn)定地傳遞下去，主要有甲基化和乙?；?。與DNA 序列的改變不同的是，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這使表觀遺傳疾病的治愈成為可能。

有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的DNA 異常甲基化的報(bào)道最早在1999 年出現(xiàn)，近年來(lái)，心血管疾病被認(rèn)為是受甲基化控制的人類重要疾病:(1)即使在相同家族或遺傳背景下，其發(fā)病也不可預(yù)測(cè);(2)出生前的影響，包括母系食譜、胎兒營(yíng)養(yǎng)及其他出生前環(huán)境的改變，均成為子代成年后疾病發(fā)生的重要誘因;(3)隨年齡增加而使疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上升［7］。

最近有學(xué)者提出染色質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化也許影響了糖尿病導(dǎo)致的血管病變［8］，而DNA 的甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，使染色質(zhì)濃縮成非活性的高級(jí)結(jié)構(gòu)。組蛋白乙?；揎棇?duì)動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控至關(guān)重要，包括血管平滑肌細(xì)胞分化、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和炎性通路［9］，但是很少有研究關(guān)于DNA 甲基化改變與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，目前已知的至少部分作用于動(dòng)脈粥樣硬化與甲基化有關(guān)的基因有干擾素γ38、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)A39，一些金屬蛋白酶類、金屬蛋白酶類組織抑制因子、胞內(nèi)黏附分子、雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)、胞外超氧化物歧化酶、p53 等。

Seppo 等研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化患者和載脂蛋白E 敲除小鼠的斑塊處，基因中的5-甲基胞嘧啶的含量顯著降低，平滑肌細(xì)胞在從收縮表型向分泌表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中表現(xiàn)出低甲基化，并且與轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)相關(guān)，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增加，多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)在試驗(yàn)中加入甲基化抑制劑脫氧氮雜胞苷后，平滑肌細(xì)胞的收縮表型標(biāo)志增加，提高了細(xì)胞的收縮性［10］。由此懷疑在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中可能同時(shí)存在特異位點(diǎn)的異常甲基化以及去甲基化，表觀遺傳改變?cè)谄交〖?xì)胞分化以及在血管損傷或者動(dòng)脈粥樣硬化表型轉(zhuǎn)化去分化時(shí)發(fā)揮重要作用［11］。

1.1 PDGF 低甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化

PDGF 是一種重要的促有絲分裂因子，具有刺激特定細(xì)胞群分裂增殖的能力。高濃度胰島素可激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放PDGF 損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能導(dǎo)致脂質(zhì)沉積，引起動(dòng)脈粥樣硬化，同時(shí)促使血管平滑肌細(xì)胞增殖［12］。實(shí)驗(yàn)證明在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，原癌基因PDGF-B 啟動(dòng)子序列是未甲基化，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖［13］，且在動(dòng)脈粥樣硬化患者的內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。在致動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，有研究發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥可以使內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-A、C、D 去甲基化，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂并激活血管平滑肌細(xì)胞促使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［14］。

1.2 ERα 高甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程同時(shí)也伴隨著DNA 高甲基化現(xiàn)象，人類ERα 與動(dòng)脈粥樣硬化和其他血管疾病密切相關(guān)。正常ERα 除了發(fā)揮抑制生長(zhǎng)作用外，還會(huì)與雌激素反應(yīng)，產(chǎn)生有保護(hù)作用的一氧化氮(NO)，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血小板激活。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，ERα 基因甲基化程度提高，導(dǎo)致其抑制生長(zhǎng)的作用減弱，從而加重血管平滑肌細(xì)胞的增殖。雌激素可以通過(guò)Ras/PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白BAD(Bcl-xl/Bcl-a-associated death promoter)的磷酸化，抵抗腫瘤壞死因子、超氧化物等因素誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程。

在各種腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)ERα 基因存在高甲基化。1999 年Wendy 等證實(shí)ERα 的甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，其發(fā)現(xiàn)與斑塊周圍正常的細(xì)胞相比，斑塊處細(xì)胞的ERα 表現(xiàn)出高甲基化。特別是內(nèi)膜細(xì)胞ERα 表現(xiàn)出低甲基化，而血管平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出高甲基化［15］，且在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)ERα甲基化程度增加［16］，也說(shuō)明血管平滑肌細(xì)胞在致動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的重要作用。

1.3 p53 高甲基化與動(dòng)脈粥樣硬化

p53 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期中具有重要作用，通過(guò)促使p21 的轉(zhuǎn)錄抑制G1 期多種酶復(fù)合物的激活，作為一個(gè)腫瘤抑制基因，p53 有抗增殖和促凋亡作用，其甲基化可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)p53及載脂蛋白E 基因敲除小鼠的后代，在高脂喂食的第6、10、15 周的動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域比p53 基因未敲除小鼠后代的損傷區(qū)域明顯增加50%～100%［17］，Rodríguez-Campos 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，早期的血管平滑肌細(xì)胞從中膜遷移需要抑制p53 基因的表達(dá)，兩實(shí)驗(yàn)說(shuō)明p53 通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。但究竟是通過(guò)什么途徑來(lái)抑制p53 基因，并沒(méi)有確切的說(shuō)明。由于p53 基因在腫瘤方面的研究，懷疑是通過(guò)某種甲基化途徑導(dǎo)致的抑制。

2 高胰島素血癥對(duì)平滑肌細(xì)胞異常甲基化的作用機(jī)制

DNA 甲基化主要通過(guò)將S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，將CpG 島二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5'位置的氫取代，從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶。在哺乳動(dòng)物中最主要的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶是甲基轉(zhuǎn)移酶1、甲基轉(zhuǎn)移酶3a 和甲基轉(zhuǎn)移酶3b。其中甲基轉(zhuǎn)移酶3a 和3b 能在未發(fā)生甲基化的DNA 雙鏈上進(jìn)行甲基化，不需要模板鏈的指導(dǎo)。甲基轉(zhuǎn)移酶1 在模板鏈的指導(dǎo)下，使半甲基化的DNA 雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化。

DNA 脫甲基化不是一種酶的作用，可能通過(guò)5-甲基脫氧胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶或通過(guò)5 位碳的氧化作用，生成5-羥甲基脫氧胞嘧啶，進(jìn)一步氧化生成甲酰胞嘧啶和羧基胞嘧啶或直接脫氨基形成5-羥甲基尿嘧啶［19］。所有這些中間體都能觸發(fā)堿基切除修復(fù)通路并且被未甲基化的胞嘧啶替換，從而脫甲基化。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳的改變可能與氧化壓力和環(huán)境因素有關(guān)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明重金屬、過(guò)氧化物酶體、空氣污染、生殖毒性物質(zhì)是重要危險(xiǎn)因素［20-21］。有趣的是高胰島素血癥使NO 的活性和活性氧族的平衡失調(diào)，活性氧族使NO 迅速形成過(guò)氧硝酸基，而過(guò)氧硝酸基是一種有力的氧化劑，并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)胰島素抵抗導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化［22］。高胰島素導(dǎo)致甲基化的作用也被證實(shí)，如Kim 等［23］通過(guò)對(duì)雄激素受體啟動(dòng)子研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗使陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞雄激素受體啟動(dòng)子甲基化，抑制了雄激素受體的表達(dá)，導(dǎo)致T2DM 患者常伴有勃起功能障礙。由于基因表觀遺傳改變可以通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制完成，由此提出假設(shè)，胰島素抵抗導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能是通過(guò)使細(xì)胞表觀遺傳改變實(shí)現(xiàn)的。

至于高胰島素血癥具體是通過(guò)何種途徑導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞基因異常甲基化現(xiàn)在還存在許多未知。有研究發(fā)現(xiàn)，高半胱氨酸可以抑制平滑肌細(xì)胞甲基化，因?yàn)楦甙腚装彼嵋种屏思谆w賴以產(chǎn)生的葉酸和維生素B12依賴的甲硫丁氨酸-S-腺蛋氨酸轉(zhuǎn)化過(guò)程。也有研究發(fā)現(xiàn)T2DM 體內(nèi)存在組蛋白甲基化酶SET7/9 和組蛋白去甲基化酶LSDl 表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而激活炎癥基因核轉(zhuǎn)錄因子κB 可能是糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要表觀遺傳機(jī)制。高胰島素導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的異常甲基化的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3 問(wèn)題與展望

表觀遺傳改變、高胰島素血癥導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化已經(jīng)逐漸被證實(shí)，高胰島素血癥使平滑肌細(xì)胞基因異常甲基化也被發(fā)現(xiàn)，但兩者導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，是否存在某種聯(lián)系尚未見(jiàn)到報(bào)道，由于基因表觀遺傳改變受多種因素影響，所以證實(shí)高胰島素血癥使基因甲基化改變從而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究顯得尤為重要。其中存在許多問(wèn)題，如基因異常甲基化如何導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，高胰島素如何導(dǎo)致基因異常甲基化，到目前為止只看到了結(jié)果，沒(méi)發(fā)現(xiàn)其作用的具體過(guò)程。

多種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中同時(shí)存在基因低甲基化與高甲基化，說(shuō)明其表型轉(zhuǎn)化是多種基因共同作用的結(jié)果，這為后續(xù)確定胰島素導(dǎo)致哪些基因異常甲基化，以及哪些基因異常甲基化是導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的主要因素的研究帶來(lái)困難，到目前為止這些基因仍然在不斷地被發(fā)現(xiàn)，最近日本學(xué)者通過(guò)對(duì)T2DM 患者粥樣斑塊周圍細(xì)胞的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的新的基因，其中絲裂原活化蛋白激酶4、E 盒結(jié)合鋅指蛋白1、蛋白激酶FYN 基因較正常細(xì)胞高甲基化，而頭套同源物、早期B 細(xì)胞因子1、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域基因較正常細(xì)胞低甲基化［24］。國(guó)際人類表觀遺傳學(xué)合作組織計(jì)劃在10 年內(nèi)繪制1 000 個(gè)參考表觀遺傳基因［25］，將會(huì)對(duì)T2DM 患者是否發(fā)生血管病變進(jìn)行表觀遺傳分析提供充足的參考，但是從眾多候選基因中，挑選出目的基因是一個(gè)艱巨的工作。

人們對(duì)心血管疾病的DNA 甲基化調(diào)控機(jī)制研究正在不斷深入，盡管高胰島素導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞基因異常甲基化的研究還在初級(jí)階段，但是這些研究有助于了解平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的新機(jī)制，隨著研究的不斷深入，將有利于為T2DM 并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化患者提供更好的臨床治療。

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