施育華，孫錦衛(wèi)，王學(xué)斌，丁會民

（鹽城市第三人民醫(yī)院普通外科，江蘇224001）

組織因子和基質(zhì)金屬蛋白酶－2在肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用

施育華*，孫錦衛(wèi)，王學(xué)斌，丁會民

（鹽城市第三人民醫(yī)院普通外科，江蘇224001）

目的：研究肝細胞肝癌組織中的組織因子（TF）及基質(zhì)金屬蛋白酶－2(MMP-2)表達，對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及兩者之間的關(guān)系。方法：用免疫組織化學(xué)EnVisionTM法檢測肝癌56例及其癌旁肝組織標(biāo)本中TF和MMP-2的表達。結(jié)果：（1）肝癌組織中TF及MMP-2的陽性表達均明顯高于癌旁組織（P<0.05）；（2）癌靜脈浸潤、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、無或包膜不完整組織中TF和MMP-2的表達顯著高于相應(yīng)對照組（P<0.05）；（3）肝癌中TF表達和MMP-2表達呈正相關(guān)。結(jié)論：HCC中TF及MMP-2表達明顯增高，且與癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

肝細胞肝癌；組織因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；免疫組織化學(xué)法

近年來發(fā)現(xiàn)組織因子（tissue factor,TF）除參與凝血外,還可促進多種腫瘤微血管的生成，促進腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一組蛋白水解酶，能有選擇的降解細胞外基質(zhì)中多種成分，分泌生長因子、細胞因子。還能激活潛在的細胞因子、生長因子以及趨化因子，清除細胞表面蛋白，在腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移、血管生成等多方面起重要作用。近來研究表明MMP-2在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和膽管癌等多種惡性腫瘤中表達明顯增多，且與腫瘤的浸潤程度和預(yù)后密切相關(guān)[1]。選取我院2010年8月—2013年8月肝癌切除手術(shù)術(shù)后病理確診56例，采取免疫組織化學(xué)法檢測人肝細胞肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)中TF及MMP-2的表達,研究其對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響及兩者之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 肝癌56例中男45例，女11例,年齡41～72歲，平均64.65歲。腫瘤直徑<5cm 41例，腫瘤≥5cm 15例，有完整包膜的32例,無包膜或包膜不完整者24例;肝內(nèi)轉(zhuǎn)移10例。血清HBsAg陽性45例,陰性11例，甲胎蛋白 (AFP)<20ng/mL 14例,≥20ng/mL 42例。所有患者術(shù)前均未行如放化療、肝動脈栓塞及免疫治療等特殊治療。

1.2 方法 （1）免疫組化染色法：兔抗人TF免疫組化單克隆抗體（濃縮型）、鼠抗人MMP-2單克隆抗體、EnvisionTMplus試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。制備4μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯溶液脫蠟,梯度乙醇水化,高溫高壓抗原修復(fù),TF抗體和MMP-2抗體的工作濃度均為1∶100。應(yīng)用EnVisionTM免疫

組化染色法，參照試劑說明書進行操作。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)分別代替TF和MMP-2單克隆抗體為陰性對照。（2）分析方法：TF及MMP-2均以細胞膜和（或）細胞質(zhì)現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，在400倍鏡下隨機選取5個區(qū)域計數(shù)。據(jù)陽性細胞所占比例判斷：染色陽性細胞比例≤10%為陰性；陽性細胞＞10%為陽性。所有切片均由我院外科及病理科經(jīng)驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法閱讀。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS19統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，組間差異性比較采用χ2檢驗，并進行TF和MMP-2 Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織因子（TF）表達 TF呈棕黃色染色，主要位于細胞質(zhì)，癌旁肝組織TF陽性4例（7.14%），HCC中TF陽性32例（57.14%)。HCC中TF陽性率明顯高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組間比較結(jié)果顯示，TF表達在靜脈浸潤、腫瘤有無包膜及肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移的HCC組織中TF陽性率較對照組明顯增高(P<0.05)。但與患者的年齡、性別、HBsAg,腫瘤大小,肝硬化因素均無相關(guān)性（P>0.05），見表1。

2.2 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）表達 HCC組織中MMP-2的陽性表達32例（62.5%）。MMP-2的陽性表達主要位于癌細胞胞質(zhì)中或胞膜上，呈棕黃色，癌旁肝組織MMP-2陽性10例（17.86%）。HCC中MMP-2陽性率明顯高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組間比較顯示，在靜脈浸潤、無包膜、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移組中明顯增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而MMP-2表達與患者年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、肝硬化未見相關(guān)性（P>0.05），見表1。

表1 TF、MMP－2的表達與肝細胞肝癌臨床病理的關(guān)系

2.3 HCC中TF表達與MMP-2表達關(guān)系 HCC組織中TF表達陽性32例中MMP-2陽性29例, MMP-2陰性3例，TF表達陰性24例中MMP-2陽性6例，MMP-2陰性18例,經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明，HCC組織中TF與MMP-2的表達呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.671，P＜0.01），提示TF和MMP-2可能協(xié)同促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3 討 論

組織因子（TF）是分子量為47kD的跨膜糖蛋白,

為機體生理性凝血的主要啟動因子，能激發(fā)外源性凝血途徑，最終生成凝血酶和纖維蛋白，從而發(fā)揮止血作用。近來研究表明TF在多種惡性腫瘤中高表達，且參與腫瘤新生血管生成，促進腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[2-3]。隨著TF研究深入，腫瘤的靶向治療前景樂觀。TF的研究在乳腺癌、肺癌、腸癌、前列腺癌、卵巢癌及食管癌等腫瘤中已開展，且顯示TF在腫瘤中的高表達，而TF在HCC中的研究尚少。本組結(jié)果示，HCC中TF陽性率為57.14%，而癌旁肝組織TF陽性率為7.14%，表明肝癌組織中TF表達增高。進一步研究發(fā)現(xiàn)靜脈浸潤、無包膜、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移的HCC患者中TF陽性率明顯增高，結(jié)果與施育華等[4-5]報道一致。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵，腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移很大程度上取決于腫瘤新生血管的生成。研究表明組織因子可通過多種途徑作用于瘤內(nèi)血管生成,但主要是促進VEGF的合成。即當(dāng)組織因子與FVIIa結(jié)合后,可激活TF胞內(nèi)端酪氨酸激酶,引起第二信使Ca2+內(nèi)流,通過MAPK或PKC途徑的信號傳導(dǎo)引起VEGF轉(zhuǎn)錄增加[6]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)。MMPs幾乎能降解細胞外基質(zhì)（ECM）中的各種蛋白成分,從而破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，因此MMPs在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用受到越來越多的重視，但具體的作用機制尚不明確。研究較多的是MMP-9和MMP-2[7-8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中MMP-2表達增加，且顯著高于正常肝細胞及癌旁組織，提示其可作為侵襲和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。本實驗利用免疫組化方法對HCC中MMP-2的表達進行研究，結(jié)果顯示HCC中MMP2表達明顯高于癌旁組織。且其表達在靜脈浸潤、無包膜、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移中增加，提示MMP-2與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)?？赡苡捎贛MP-2被激活后可形成Ⅳ型膠原酶降解和破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質(zhì)，使腫瘤細胞向周圍組織侵潤，最終導(dǎo)致腫瘤局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)HCC中TF的表達和MMP-2的表達具有正相關(guān)性，提示在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中，TF及MMP-2可能有協(xié)同作用。研究表明TF在腫瘤細胞中，可以作用于MMP-2[11]降解血管局部細胞外基質(zhì)和基底膜后，促進內(nèi)皮細胞芽生、增殖和遷移直至管腔形成。同時腫瘤細胞表面的TF可與配體FVIIa結(jié)合后，啟動外源性凝血途徑，使得腫瘤患者體內(nèi)高凝狀態(tài)的形成。促凝血活性的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移播散后，包裹在血小板纖維蛋白的聚合物中，可躲避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，在靶器官中形成轉(zhuǎn)移灶。

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Effects of tissue factors and matrix metalloproteinase-2 in invasion capability of hepatocellular carcinoma

SHI Yuhua,SUN Jinwei,DING Huimin
(Department of General Surgery,Third Hospital of Yancheng,Jiangsu 224001)

Objective:To study the expression of tissue factor（TF）and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in hepatocellular carcinoma(HCC)and explore the effects of TF and MMP-2 on cell invasion and metastasis of HCC.Methods:The expression of TF and MMP-2 in 56 specimens of HCC and adjacent normal liver tissues were detected by EnVisionTM immunohistochemistry.Results:The expression levels of TF and MMP-2 were obviously higher in HCC tissues than that in tumor-adjacent normal tissues(P<0.05);MMP-2 and TF expression was correlated to vein invasion,intrahepatic metastasis, and the tumor without envelope(P<0.05)．It had coherence abaout the expression of TF and MMP-2(P<0.01).Conclusion:The expression of TF and MMP-2 HCC may be related to the in invasion and metastasis of HCC.

hepatocellular carcinoma;tissue factor;matrix metalloproteinase-2;immunohistochemistry

R735.7

A

施育華，男，漢族，江蘇鹽城人，生于1972年6月，本科，主任醫(yī)師。研究方向：腫瘤外科。

2014-06-15

1006-2440（2014）04-0331-03