張亞莉，孫利軍

（南通大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇226001）

c-Jun氨基末端激酶活化在三丁基錫誘導(dǎo)凋亡中的作用及機制*

張亞莉1**，孫利軍2

（南通大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇226001）

目的：研究c-jun氨基末端激酶（JNK）參與三丁基錫（Tributyltin,TBT）誘導(dǎo)正常人羊膜細(xì)胞FL凋亡的分子機制。方法：FL細(xì)胞經(jīng)不同濃度TBT染毒1h后，PI/Annexin V雙染色法檢測FL細(xì)胞凋亡率。Western blot檢測FL細(xì)胞JNK的磷酸化水平，Bax定位、Bcl-2的磷酸化水平及總Bax和Bcl-2表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，4μmol/L和6 μmol/L的TBT染毒劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高，2μmol/L～6μmol/L劑量組JNK磷酸化水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。JNK特異抑制劑SP600125明顯降低TBT誘導(dǎo)的FL細(xì)胞凋亡率，而JNK特異抑制劑SP600125對Bax定位、Bcl-2的磷酸化水平及總的Bax和Bcl-2表達(dá)量無影響。結(jié)論：JNK的活化是TBT誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡的重要因素，但JNK介導(dǎo)凋亡的途徑并非通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2。

三丁基錫；凋亡；c-jun氨基末端激酶;Bax;Bcl-2；流式細(xì)胞技術(shù)；Western blot檢測

1 材料和方法

1.1 材料 電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（BIO-RAD公司，美國），Microfuge.R低溫高速離心機（Beckman公司，美國），Thermomixer舒適型恒溫混勻器（Eppendorf公司，德國），Kadok凝膠圖象分析系統(tǒng)（Life Technologies公司，美國），流式細(xì)胞分析儀（Beckman公司，美國）。TBT（無色液體，純度90%，Acros公司，美國）；phospho-JNK(Thr183/Tyr185)，JNK，Bax，phospho-Bcl-2(Ser70)，Bcl-2（Cell Signaling Technology公司，美國）；PI/Annexin V雙染凋亡檢測試劑盒（聯(lián)科生物公司，中國）

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及處理：FL細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中，在37℃及5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，隔天傳代1次。實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。TBT溶于無水乙醇，至濃度為5mmol/L，儲存于4℃。細(xì)胞生長24小時后，向培養(yǎng)體系中加入TBT至終濃度0,1,2,3,4和6 μmol/L，作用時間1h后進行各指標(biāo)的測定。（2）PI/Annexin V雙染色法檢測FL細(xì)胞凋亡率：離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗。然后用500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，室溫避光溫育5 min。流式細(xì)胞儀對樣品進行檢測。（3）FL細(xì)胞全蛋白的提取：離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗，細(xì)胞重懸于裂解液中，50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，pH 7.6。冰上靜置30 min，20 000 g，30 min，4℃離心，收集上清。采用Bradford法測定蛋白濃度。（4）FL細(xì)胞線粒體/胞漿蛋白提?。弘x心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗，細(xì)胞重懸于裂解液中，250 mmol/L sucrose，20 mmol/L HEPES，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1mmol/L PMSF。冰上靜置40 min，1mL注射器吹打約50次，800g，10 min，4℃離心后取上清，20 000 g，30 min，4℃離心，收集上清液即為胞漿蛋白；沉淀加裂解液吹打重懸此為線粒體蛋白，Bradford法測蛋白濃度。（5）Western blot檢測FL細(xì)胞JNK、Bax和Bcl-2表達(dá)：將提取的蛋白與4×上樣緩沖液以1∶1體積比混合，沸水浴5 min使蛋白變性。蛋白上樣于濃度為5%積層膠和12%的分離膠，積層膠電壓50 V，分離膠電壓90 V，進行電泳；之后于恒壓100 V轉(zhuǎn)膜90 min。將轉(zhuǎn)有蛋白的硝酸纖維素膜浸于含5%脫脂牛奶的TBS-T（0.1%的Tween-20）中，在室溫下振蕩3 h阻斷非特異性結(jié)合。取出已封閉的硝酸纖維素膜，浸于按抗體說明書推薦比例稀釋后的一抗稀釋液中，4℃溫和振蕩過夜，TBST漂洗10min×3次。再浸于按抗體說明書要求稀釋的二抗中室溫溫和振蕩2 h，再次TBST漂洗10min×3次。在暗室中將NC膜置于ECL液中1～2min，吸去多余的ECL液后用保鮮膜包好，放入暗盒內(nèi)。用X線膠片進行曝光、顯影及定影，待膠片晾干后在成像儀中拍照。使用Quantity ONE軟件對目的蛋白進行積分吸光度(integrated absorbance，IA)光密度分析。目的蛋白相對表達(dá)水平=IA目的蛋白/IAGAPDH。目的蛋白磷酸化水平=IA磷酸化蛋白/IA總蛋白，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s進行表示。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析。組間兩兩比較時，若方差齊時，采用SNK檢驗；若方差不齊時，采用Games-Howell檢驗。率的比較采用χ2檢驗。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TBT對FL細(xì)胞凋亡率和JNK磷酸化水平的影響 與對照組相比，4μmol/L和6μmol/LTBT染毒組FL細(xì)胞凋亡率增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。與對照組相比，JNK磷酸化水平從2μmol/L劑量組開始升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；且隨著TBT染毒劑量的增加，JNK的磷酸化水平呈上升趨勢（表1，圖1）。

表1 TBT對FL細(xì)胞凋亡率及JNK磷酸化水平的影響（n=3，±s）

表1 TBT對FL細(xì)胞凋亡率及JNK磷酸化水平的影響（n=3，±s）

與對照組（0 μmol/L）比較，**P<001

?

圖1 TBT對FL細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響

2.2 JNK抑制劑SP600125對FL細(xì)胞凋亡率的影響 SP600125預(yù)處理細(xì)胞后，通過比較單染TBT組和TBT及抑制劑復(fù)染組凋亡率的差別，確定JNK的活化是否參與TBT誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡。結(jié)果如圖2和表2所示，與4μmol/L和6μmol/L TBT單染組比較，SP600125和TBT復(fù)染組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<001）。

圖2 JNK抑制劑SP600125（SP)對TBT誘導(dǎo)凋亡率影響的流式散點圖

表2 JNK抑制劑SP600125對FL細(xì)胞凋亡率的影響（n=3，±s）

表2 JNK抑制劑SP600125對FL細(xì)胞凋亡率的影響（n=3，±s）

組別 凋亡率(100%) 0μmol/L 0.87±0.05 20μmol/L SP600125 0.66±0.22 4μmol/L TBT 24.30±3.79 4μmol/L TBT+20μmol/L SP600125 13.70±4.39**6μmol/L TBT 31.47±3.47 6μmol/L TBT+20μmol/L SP600125 24.08±3.43*

2.3 JNK抑制劑SP600125對FL細(xì)胞Bax和Bcl-2的影響 結(jié)果如圖3所示，加入SP600125預(yù)染FL細(xì)胞后，Bax定位、Bcl-2的磷酸化水平及總的Bax和Bcl-2表達(dá)量在4μmol/L或6μmol/L TBT單染組較加入抑制劑復(fù)染組間無差別。

圖3 JNK抑制劑SP600125（SP）對Bax定位、Bcl-2的磷酸化水平以及總的Bax和Bcl-2表達(dá)量影響

3 討 論

本研究結(jié)果表明，TBT在誘導(dǎo)FL細(xì)胞調(diào)亡時，在相同的劑量組均發(fā)現(xiàn)JNK磷酸化水平升高，即被活化，提示JNK的活化可能參與TBT誘導(dǎo)的凋亡。為了更進一步確定JNK的活化參與TBT誘導(dǎo)的凋亡，本實驗在TBT染毒前先加入JNK的特異性抑制劑SP600125預(yù)處理FL細(xì)胞。通過比較單染TBT組和TBT及抑制劑復(fù)染組凋亡率的差別，確定JNK的活化是否參與細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，SP600125（JNK特異抑制劑）預(yù)處理細(xì)胞后，TBT和SP600125復(fù)染組細(xì)胞凋亡率明顯較4，6μmol/L TBT單染組降低，證實JNK的活化參與TBT誘導(dǎo)的FL細(xì)胞凋亡。

Bax和Bcl-2是調(diào)控線粒體凋亡途徑中最為關(guān)鍵的蛋白。Bax從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)位致使線粒體滲透轉(zhuǎn)移孔（permeability transition pore，PTP）開放，誘發(fā)線粒體跨膜電位（mitochontrial membrane potential，ΔΨm）下降和細(xì)胞色素C釋放，最終激活casapse-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？沟蛲鲱惖鞍譈c1-2則可通過與Bax競爭或者直接阻止Bax與PT孔組成蛋白結(jié)合，發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。Bcl-2的穩(wěn)定性受其本身ser70位點磷酸化的調(diào)控，Bcl-2在ser70磷酸化后被降解。減少和Bax異二聚體的形成，利于更多的Bax之間形成同二聚體，開放PTP促進凋亡發(fā)生。因此Bax的定位、Bcl-2的磷酸化水平及它們表達(dá)量均是調(diào)控線粒體凋亡的重要因素。JNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制十分復(fù)雜，有研究表明JNK可通過調(diào)控

Bax和Bcl-2促進線粒體凋亡途徑[11]。也有研究顯示活化的JNK可轉(zhuǎn)位至線粒體，引起細(xì)胞色素c釋放，導(dǎo)致線粒體凋亡[12-13]。本研究在確定JNK的活化參與TBT誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡后，通過比較單染TBT組和SP600125及TBT復(fù)染組對Bax定位、Bcl-2的磷酸化水平（ser70）以及總的Bax和Bcl-2表達(dá)量，探討JNK引起凋亡的分子機制。結(jié)果表明JNK參與細(xì)胞凋亡的分子機制，并不是通過調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白的改變。因此在本實驗條件下，JNK參與TBT誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡可能和其轉(zhuǎn)位至線粒體，改變線粒體膜通透性，促進細(xì)胞色素c釋放有關(guān)，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，JNK的活化是TBT誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡的重要因素，但JNK介導(dǎo)凋亡的途徑并非通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2。

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The effect of JNK activation on TBT-induced apoptosis and its possible mechanism

ZHANG Yali1，SUN LiJun2
(1Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Medicine，Nantong University，Jiangsu 226001;2School of Public Health,Nantong University)

Objective:To study the effects of JNK activation on TBT-induced apoptosis and investigate the underlying mechanism in human amnionic cells.Methods:In the study,PI/Annexin V staining assay was applied to detect apoptosis induced by TBT in FL cells.The phosphorylation of JNK,expression and localization of Bax,and the expression and phosphorylation of the Bcl-2,respectively,were measured by Western blot.Results:Compared with the control group,the proportion of apoptotic FL cells were increased in the 4 and 6 μmol/L TBT-treated groups,and the phosphorylation of JNK was markedly increased in the 2,3,4 and 6 μmol/L TBT-treated groups(P<0.01).JNK-specific inhibitor attenuated the TBT-mediated elevation of apoptotic rates.However,JNK-specific inhibitor had no effect on the expression and localization of Bax,as well as the expression and phosphorylation of the Bcl-2.Conclusion:JNK activation in apoptotic human amnion cells is not involved in the upstream signaling of the Bax/Bcl-2-evoked mitochondrial apoptosis pathway.

tributyltin;apoptosis;c-Jun N-terminal kinases;Bax;Bcl-2;flow cytomertry(FCM);Western blot

Q555+.7

A

江蘇省自然科學(xué)青年基金（BK20130397；BK20130389）；南通大學(xué)博士引進人才啟動基金（13R26）。

2014-05-31

1006-2440（2014）04-0327-04

**[作者簡介]張亞莉，女，漢族，江蘇南通人，生于1978年3月，講師，博士，研究方向：生化毒理學(xué)。 通信作者：孫利軍，E-mail:slj. 1226@163.com

三丁基錫（Tributyltin,TBT）是具有極強毒性的環(huán)境污染物。其主要的用途是作為殺蟲劑添加到涂料中涂于船體及海洋建筑的表面，以防止軟體海洋生物的附著。TBT具有高度的脂溶性和低的生物降解性，極易在水生生物體內(nèi)富集，并經(jīng)食物鏈傳遞給高營養(yǎng)等級動物，進而可能影響到人類健康[1-3]。已有大量報道顯示TBT能引起哺乳類動物免疫、神經(jīng)、生殖以及肝毒性，而凋亡誘導(dǎo)一直被認(rèn)為是TBT產(chǎn)生毒性最主要的機制[4-8]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）屬于細(xì)胞內(nèi)一類較為保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，其家族成員c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）通過和凋亡關(guān)鍵分子相互作用參與凋亡的調(diào)控[9]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)TBT能夠誘導(dǎo)FL細(xì)胞凋亡[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步探討JNK活化在TBT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機制。