吳 鋒，秦巨峰

（1南通大學藥學院藥理系，江蘇226001；2南通大學附屬醫(yī)院影像科）

·論著與基礎(chǔ)研究·

自噬誘導劑海藻糖對帕金森癥小鼠的治療作用*

吳 鋒1**，秦巨峰2

（1南通大學藥學院藥理系，江蘇226001；2南通大學附屬醫(yī)院影像科）

目的：探討自噬誘導劑海藻糖對帕金森癥小鼠的治療作用。方法：使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽（MPTP）建立小鼠帕金森癥模型，通過觀察小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺（DA）神經(jīng)元數(shù)量、紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺及代謝產(chǎn)物變化，判斷海藻糖治療帕金森癥的作用。結(jié)果：（1）免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MPTP使小鼠黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。海藻糖干預后可增加DA神經(jīng)元數(shù)量。（2）HPLC檢測發(fā)現(xiàn)MPTP造成小鼠紋狀體中多巴胺明顯減少，海藻糖組可增加神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物。結(jié)論：海藻糖能減少MPTP造成的黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元丟失，增加紋狀體中多巴胺的含量，海藻糖能有效治療帕金森癥。

帕金森癥；自噬；海藻糖；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽；免疫組織化學法；小鼠

海藻糖（trehalose）是一種由兩個葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的天然非還原性雙糖，通過蛋白質(zhì)-海藻糖相互作用影響蛋白質(zhì)折疊，對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護作用[1]。海藻糖通過非依賴哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號轉(zhuǎn)導途徑誘導自噬，清除神經(jīng)元內(nèi)突變型亨廷頓蛋白和α-突觸核蛋白對多種神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生治療作用[2-3]。帕金森癥（PD）是一種中老年常見的慢性進展性神經(jīng)退行性疾病，它以中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）神經(jīng)元缺損為主要病理基礎(chǔ)。本實驗以MPTP制備帕金森癥小鼠模型，觀察海藻糖能否起到治療作用，為臨床應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride，MPTP，sigma，3.5mg·mL-1），溶于0.9%生理鹽水溶液；海藻糖（sigma，0.2mg·mL-1），溶于0.9%生理鹽水溶液；清潔級雄性C57bl/6小鼠，質(zhì)量25～30 g，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2003—0003。

1.2 方法 （1）分組：C57bl/6小鼠60只，隨機分為4組，每組15只，分別為生理鹽水正常對照組、MPTP模型組、海藻糖正常對照組和海藻糖治療組。MPTP 20mg·kg-1腹腔注射，每隔2h連續(xù)注射4次，造模7d后取材。海藻糖2g·kg-1于MPTP最后1次注射后腹腔注射，每隔2d注射1次，同時予2%溶于雙蒸水普通喂養(yǎng)[4]，將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進食。（2）免疫組化檢測：7天后小鼠以4%戊巴比妥鈉麻醉，順序灌注PBS（pH值7.4)和

4%多聚甲醛(pH值7.4)，灌流后鼠腦在4%多聚甲醛中后固定6h,冰凍切片機制備中腦區(qū)腦片(40μm)。予0.5%Triton x-100透膜，5%山羊血清封閉，酪氨酸羥化酶抗體（1∶2 000）一抗孵育過夜，生物素二抗（1∶500），ABC法用于檢測抗原（1∶100），DAB染色拍片。（3）HPLC檢測：小鼠斷頭后迅速取出全腦，在4℃冰浴中迅速分離出紋狀體，稱重后立即投入液氮中。每10mg組織加0.2mL內(nèi)標溶液（高氯酸0.1mol/L，3,4二羥基芐胺0.1μg/mL，焦亞硫酸鈉0.04%，EDTA0.04%），在冰浴下用玻璃勻漿器勻化1min。然后4℃14 000×離心20min，取出上清液，置于-80℃凍存，每次取20μL注入HPLC進行分析檢測。

**[作者簡介]吳鋒，男，漢族，江蘇南通人，生于1980年10月，碩士，講師。研究方向：神經(jīng)藥理學。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS13.0軟件分析處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，計量數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

酪氨酸羥化酶免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MPTP制備帕金森癥小鼠急性模型造成C57bl/6小鼠黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。海藻糖干預后可以減輕MPTP的急性損傷作用，增加DA神經(jīng)元數(shù)量，見圖1（P<0.05）。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)MPTP造成C57bl/6小鼠紋狀體中，DA神經(jīng)元突觸投射區(qū)內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)均明顯減少。海藻糖組可以增加上述神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物，見圖2～4（P<0.05）。

圖1 海藻糖對MPTP帕金森癥模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元存活數(shù)量的影響

圖2 海藻糖對帕金森癥小鼠紋狀體中多巴胺的影響

圖3 海藻糖對帕金森癥小鼠紋狀體中DOPAC的影響

圖4 海藻糖對帕金森癥小鼠紋狀體中HVA的影響

3 討 論

目前研究認為帕金森癥病因可能是環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用結(jié)果，近年來發(fā)現(xiàn)線粒體功能缺陷在帕金森癥中起重要作用[5]。MPTP模型是通過損傷中腦DA神經(jīng)元線粒體功能，引發(fā)帕金森癥的最常用的動物模型。該模型具備成模穩(wěn)定，制備簡單等優(yōu)點，而且MPTP是目前唯一已知的可以在人類及靈長目動物造成帕金森癥的神經(jīng)毒素[6]。破損的線粒體可增加活性氧（ROS）的釋放損傷神經(jīng)元，所以加速清除已經(jīng)喪失功能的破損線粒體已經(jīng)成為帕金森癥治療的新的靶點[7]。自噬是真核細胞特有的生命現(xiàn)象，在一些生理和應激、毒素、饑餓等病理因素的誘導下，由一種前自噬結(jié)構(gòu)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，延伸包裹待降解的蛋白質(zhì)、破損細胞器，形成自噬體。然后自噬體的外膜和溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體。內(nèi)膜和包裹的物質(zhì)進入溶酶體腔，被蛋白水解酶降解，降解后的成分可被細胞循環(huán)利用，從而維持了細胞的自身穩(wěn)定[8]。海藻糖是一種典型的非依賴mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑的自噬誘導劑，本身作為食品不具備毒性，同時能夠加速自噬流幫助清除帕金森癥致病因素中的累積的破損線粒體。實驗發(fā)現(xiàn)在帕金森癥病理過程中，海藻糖能夠有效遏制黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元丟失，起到治療帕金森癥的目的，但詳細機制有待進一步研究。

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The Effect of Trehalose,an Autophagy Enhancer, in the MPTP Model of Parkinson’s Disease

WU Feng1,QIN Jufeng2
(1Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Nantong University,Jiangsu 226001；1Department of Radiology，Affiliated Hospital of Nantong University)

Objective:To explore the effect of trehalose in the MPTP model of Parkinson’s disease.Methods:The number of surviving dopaminergic(DA)neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc)and levels of dopamine and its main metabolites,3,4-dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in striatum were evaluated.Results:Trehalose rescued midbrain DA neurons from MPTP toxicity and increased the levels of dopamine,DOPAC,and HVA in striatum.Conclusion:Trehalose could be used for treatment of Parkinson’s disease.

Autophagy;Trehalose;Parkinson’s disease;MPTP

R742.5

A

國家青年科學基金項目（31300893）；南通市科技項目（BK2012094）。

2014-07-03

1006-2440（2014）04-0316-03