馬亦良，黃 娟，白 軍

（1.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東深圳518133；2.杭州市紅十字會醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江杭州31003）

胎盤細胞凋亡與早產(chǎn)流產(chǎn)關系研究

馬亦良1，黃 娟1，白 軍2*

（1.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東深圳518133；2.杭州市紅十字會醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江杭州31003）

目的研究早產(chǎn)流產(chǎn)與胎盤細胞凋亡關系及其可能機制。方法隨機選取正常妊娠足月分娩胎盤30例，早產(chǎn)胎盤30例，流產(chǎn)胎盤30例，取胎盤組織制備單細胞懸液，F(xiàn)CM檢測胎盤細胞的凋亡率；DNA瓊脂糖電泳檢測胎盤細胞的凋亡特征性DNA條帶；westernblot檢測細胞凋亡相關蛋白表達。結果早產(chǎn)和流產(chǎn)胎盤細胞的凋亡率，明顯高于正常妊娠分娩的胎盤細胞的凋亡率（P＜0.05）；同時瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型的凋亡細胞DNA梯形條帶，伴隨著bcl－2蛋白表達下調，bax、cyt－c、caspase－9和caspase－3蛋白表達上調，bcl－2／bax比值下降。結論早產(chǎn)流產(chǎn)可能與胎盤細胞啟動線粒體途徑凋亡密切相關。

早產(chǎn)；流產(chǎn)；凋亡；線粒體途徑

流產(chǎn)（abortion）是指妊娠不足28周，胎兒體重不足1000g而終止者［1］；早產(chǎn)（premature delivery）是指妊娠滿28周至不足37周間分娩者［2］，早產(chǎn)和流產(chǎn)不僅給患者帶來生理上精神上的傷害，還伴有沉重的經(jīng)濟負擔，有的甚至導致流產(chǎn)后不孕不育，早產(chǎn)流產(chǎn)后抑郁等疾患。既往研究認為早產(chǎn)流產(chǎn)原因為染色體異常、免疫異常，目前研究認為流產(chǎn)和早產(chǎn)與胎盤細胞凋亡密切相關，胎盤細胞凋亡可以引起多種妊娠合并癥［3］，為此本研究探討早產(chǎn)流產(chǎn)與胎盤細胞凋亡的關系及其可能的分子生物學機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

實驗標本來源于2012－10～2013－10于深圳市寶安區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科足月妊娠分娩胎盤組織30例（分娩過程中未使用藥物處理），流產(chǎn)患者胎盤組織30例（入院診斷為難免流產(chǎn)，未使用藥物保胎），早產(chǎn)胎盤組織30例（入院診斷為難免早產(chǎn)，未使用藥物保胎），排除高血壓、糖尿病等妊娠合并癥，排除癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，排除母兒血型不合等免疫系統(tǒng)疾病，診斷標準參照第七版婦產(chǎn)科學［4］。

1.2 標本采集

所有的胎盤組織標本均在手術室，于無菌狀態(tài)下切取，共3份，每份大小約1 cm×l cm×l cm，均用4℃的PBS清洗2次。用眼科剪反復剪碎組織塊后，用200目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細胞懸液，備用。

1.3 儀器與設備

流式細胞儀為美國Coulter公司生產(chǎn)的Epics－XL型，結果采用Multicycle軟件分析。垂直電泳儀和電泳槽為美國BIO－RAD公司產(chǎn)品，結果采用Alpha Imager 2200軟件分析。

1.4 FCM檢測胎盤細胞凋亡率

計數(shù)各組胎盤組織細胞，分別取約含1×106細胞懸液，用PBS清洗2遍后，加入4℃的75％乙醇混勻固定，4℃過夜后PI避光染色30min，進行流式細胞儀檢測［5］，以上實驗重復3次。

1.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測胎盤細胞凋亡

取上述各組胎盤組織細胞，加入細胞裂解液裂解，離心、除沉，加RNA酶，提取細胞DNA，取10μg定量樣品與適量加樣緩沖液混勻后，用1.5％瓊脂糖凝膠在50V恒壓下電泳，EB染色，紫外透射反射儀下檢測，并用自動成像系統(tǒng)（Polaroid）拍照［6］。

1.6 western blot檢測胎盤細胞凋亡相關蛋白表達

取各組胎盤組織細胞，加入細胞裂解液冰面裂解提取蛋白，取30μg定量樣品用SDS－PAGE電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜上，再用5％脫脂牛奶－TBST室溫搖床封閉2 h，一抗于37℃孵育3 h，二抗于37℃孵育1 h，ECL發(fā)光劑激發(fā)熒光，壓片顯影定影［8］。結果用灰度掃描儀處理分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 FCM檢測早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤組織細胞凋亡率

正常妊娠足月分娩胎盤組織細胞、早產(chǎn)胎盤組織細胞、流產(chǎn)胎盤組織細胞均有凋亡發(fā)生，凋亡率分別為5.88％、15.64％和27.32％，早產(chǎn)胎盤組織細胞與流產(chǎn)胎盤組織細胞凋亡率明顯高于正常分娩族，個組間比較差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），見圖1。

圖2 FCM檢測早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤細胞凋亡率

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤組織細胞凋亡

凋亡特異性的生化特征是核DNA在核小體連接處被切斷，形成180～200 bp或其整數(shù)倍大小的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為梯狀條帶。本研究結果顯示早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤細胞DNA瓊脂糖電泳均出現(xiàn)了典型的梯狀條帶，而正常分娩的胎盤細胞梯形條帶不明顯，可能與足月分娩胎盤細胞發(fā)生凋亡數(shù)量少有關。本研究結果進一步證實了早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤細胞明顯發(fā)生凋亡，見圖2。

圖2 DNAladder檢測早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤細胞凋亡

2.3 Western blot檢測流產(chǎn)早產(chǎn)胎盤組織細胞凋亡相關蛋白表達

早產(chǎn)和流產(chǎn)胎盤組織細胞的bcl－2蛋白表達下調，與正常妊娠足月分娩胎盤組織細胞比較，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；早產(chǎn)和流產(chǎn)胎盤組織細胞的Bax、Cyt－c、Caspase－9和Caspase－3蛋白表達上調，與正常妊娠足月分娩胎盤細胞蛋白比較，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而且bcl－2／Bax比值，早產(chǎn)流產(chǎn)組明顯高于正常妊娠足月分娩組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western Blot檢測早產(chǎn)流產(chǎn)胎盤細胞凋亡相關蛋白表達

3 討論

早產(chǎn)和流產(chǎn)是婦產(chǎn)科臨床常見的一種多發(fā)病和常見病，長期以來給孕產(chǎn)婦的身心健康帶來巨大的痛苦，也是一直困擾婦產(chǎn)科臨床工作者的主要問題［1，2］。既往研究認為早產(chǎn)流產(chǎn)原因為胚胎因素、母體因素、免疫異常和環(huán)境因素；對早產(chǎn)的原因多集中在子宮畸形，生殖道感染，妊娠合并癥和并發(fā)癥上，目前有研究表明早產(chǎn)和流產(chǎn)與胎盤細胞凋亡密切相關，胎盤細胞凋亡可以引起多種妊娠合并癥［1，2］，為此本研究探討早產(chǎn)流產(chǎn)與胎盤細胞凋亡的關系及其可能的分子生物學機制。

細胞凋亡是由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡，是細胞的一種程序性死亡的形式之一，凋亡與生物胚胎發(fā)生發(fā)育，成熟細胞新舊交替，激素依賴性生理退化，自身免疫性疾病，腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。凋亡是多因素、多階段和多基因嚴格控制的過程，現(xiàn)在研究細胞凋亡控制途徑主要有兩條，一條是死亡受體介導的外源性凋亡通路，另一條是線粒體途徑介導的內源性凋亡通路［5］。Bcl－2家族成員通過調控線粒體信號轉導系統(tǒng)而調控內源性凋亡途徑，其中Bcl－2蛋白和Bax蛋白是Bcl－2家族成員中兩個重要的成員，共同組成調控Cyt－c的釋放通道，Bcl－2蛋白具有抑制Cyt－c釋放的功能，而Bax則促進Cyt－c釋放，Bcl－2／Bax決定了線粒體外膜的通透性和阻止細胞色素c的釋放的量［6，7］；Cyt－c是細胞線粒體凋亡途徑的關鍵，Cyt－c進入胞漿后，即與Apaf－1、ATP／dATP結合成凋亡體復合物［8］，凋亡體復合體進而激活caspase－9蛋白，而caspase－9蛋白可以通過水解caspase－3前體蛋白［9］，激活caspase－3蛋白，而caspase－3蛋白是細胞凋亡的執(zhí)行者，它可以直接降解細胞內的結構蛋白和功能蛋白引起細胞凋亡，可以使細胞質、細胞核、細胞骨架的重要蛋白降解失活，而導致細胞發(fā)生凋亡［10］。本研究表明，早產(chǎn)和流產(chǎn)的患者，其胎盤組織細胞出現(xiàn)大量凋亡，與正常妊娠足月分娩的胎盤組織細胞相比，差異有明顯的統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時調控內源性凋亡途徑的線粒體途徑的關鍵蛋白Bcl－2表達下調，而Bax、Cyt－c、Caspase－9和Caspase－3蛋白表達上調，同時Bcl－2／Bax比值降低，提示早產(chǎn)和流產(chǎn)可能與胎盤細胞啟動內源性線粒體凋亡途徑引起胎盤組織細胞凋亡相關。

綜上所述，早產(chǎn)和流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展與胎盤組織細胞凋亡有密切的關系，隨著妊娠的進展，胎兒及胎盤組織也相互成比例相適應的生長而漸趨增大，在此期間，胎盤組織細胞始終處于內外各種因素的刺激下，若胎盤細胞在各種因素刺激下發(fā)生凋亡過多，就會使具有功能效用胎盤細胞數(shù)量減少，不能滿足胎兒需要的時候，就會導致早產(chǎn)流產(chǎn)，這提示胎盤細胞發(fā)生凋亡以及發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量可能與早產(chǎn)流產(chǎn)的發(fā)生有關，阻止抑制胎盤細胞的凋亡有助于減少早產(chǎn)流產(chǎn)的發(fā)生，這為我們從生物醫(yī)學角度治療早產(chǎn)流產(chǎn)提供了理論依據(jù)，但是相關研究還待繼續(xù)深入，尤其是胎盤組織細胞發(fā)生凋亡其它機制的進一步探討。

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The relationship between premature delivery／abortion and apoptosis of placental cells

MA Yi-liang1，HUANG Juan2，BAI Jun3
（1.Shenzhen Baoan District Maternal and Child Hospital，Shenzhen 518133，China；

ObjectiveThe aim of this study is to investigate the relationship between premature delivery／abortion and apoptosis of placental cells viamitochondrial way and its possiblemolecularmechanism.M ethods30 placenta of term delivery，30 placenta of premature delivery，and 30 placenta of abortion were selected randomly.The suspension of single placental cells wasmade，and apoptosis rate of placental cells was detected by FCM，the laddershaped band was detected by DNA agarose gel electrophoresis，the expression of apoptosis related proteins was assessed by western blot.ResultsThere was significant difference in apoptosis of placental cells between premature delivery／abortion，compared with term delivery group（P＜0.05）.DNA agarose gel electrophoresis showed the typical ladder－shaped band of apoptosis，accompanied by the down－regulation of Bcl－2 protein，and the up－regulation of Bax，Cyt－c，Caspase－9 and Caspase－3 protein，and the ratio of Bcl－2／Bax decreased.ConclusionPremature delivery／abortion may be related to triggering placental cells apoptosis via themitochondrial pathway.

premature delivery；abortion；apoptosis；mitochondrial pathway

R74.21

A

1672－2639（2014）01－0022－042.Department of Obstetric and Gynecology，Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou，310003，China）

2014－01－06；責任編輯 趙菊梅］

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白 軍，Email：szbamyl2013＠126.com