解雁飛，李 穎，李紅梅

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科一病區(qū)，陜西延安716000）

水通道蛋白-9和Caspase3在胎膜組織中的表達(dá)及與羊水過(guò)少的相關(guān)性研究

解雁飛，李 穎，李紅梅

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科一病區(qū)，陜西延安716000）

目的探討水通道蛋白－9（AQP－9）和凋亡蛋白Caspase3在羊水過(guò)少產(chǎn)婦和羊水量正常的產(chǎn)婦胎膜中的表達(dá)差異。方法采用免疫組化方法（SP法）分別檢測(cè)30例羊水過(guò)少和30例羊水量正常產(chǎn)婦胎膜組織中AQP－9和Caspase3的蛋白表達(dá)水平，并分析這兩種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果AQP－9和Caspase3蛋白在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組產(chǎn)婦的胎膜中均有陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組胎膜中的AQP－9蛋白表達(dá)水平明顯比對(duì)照組低，Caspase3的表達(dá)卻明顯比對(duì)照組高，而兩者的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)AQP－9與Caspase3在羊水過(guò)少組胎膜細(xì)胞中的表達(dá)卻呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.72，P＜0.05）。結(jié)論羊水過(guò)少組孕婦胎膜中AQP－9蛋白的低表達(dá)與Caspase3蛋白的高表達(dá)，提示AQP－9和Caspase3在產(chǎn)婦胎膜中的異常表達(dá)可能是羊水過(guò)少發(fā)生的原因之一。

羊水過(guò)少；胎膜；水通道蛋白；凋亡蛋白；免疫組織化學(xué)

羊水是羊膜腔中的液體，胎兒在羊水中活動(dòng)并生長(zhǎng)發(fā)育。臨床上將妊娠晚期也就是妊娠超過(guò)28周而羊水量少于300 ml者稱為羊水過(guò)少。羊水量減少會(huì)使宮縮時(shí)子宮與胎兒之間的緩沖減少，臍帶也容易受壓，使胎兒發(fā)生宮內(nèi)缺氧率大大增加［1］；同時(shí)羊水過(guò)少時(shí)胎肺膨脹受阻影響胎肺的發(fā)育，更容易發(fā)生新生兒窒息［2］。目前仍有一部分羊水過(guò)少的病因尚不明確，因此研究羊水平衡的調(diào)控對(duì)預(yù)防、診斷和治療羊水過(guò)少有著重要意義。羊水的生成與吸收所構(gòu)成的平衡決定著羊水量的正常與否。近年來(lái)AQP在孕婦胎盤胎膜上的分布及其與羊水調(diào)節(jié)關(guān)系的研究已逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視。研究發(fā)現(xiàn)在胎盤胎膜上只有AQPl、3、8、9的表達(dá)，而Caspase3作為一種凋亡因子，可調(diào)控胎膜中多種細(xì)胞的凋亡，可能與羊水過(guò)少的發(fā)生有關(guān)。因此研究水通道蛋白9與Caspase3調(diào)控胎膜兩側(cè)羊水平衡及其與羊水量異常的關(guān)系目前廣受關(guān)注。本研究運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)AQP9和Caspase3在羊水量正常組和羊水過(guò)少組孕婦胎膜中的表達(dá)差異及探討其與羊水過(guò)少之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013－06～2013－09在延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科足孕月（37～41周）剖宮產(chǎn)分娩的羊水過(guò)少組產(chǎn)婦及正常組產(chǎn)婦各30例（羊水過(guò)少組初選入組為43例，剔除13例；正常組初選入組為45例，剔除15例），兩組孕婦年齡、孕周、孕次和胎膜重量等均無(wú)顯著性差異，既往無(wú)內(nèi)外科合并癥及其他妊娠合并癥（妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胎兒畸形及其他并發(fā)癥，近期無(wú)藥物服用史，感染及母體脫水等因素。羊水正常組剖宮產(chǎn)的指征有前次剖宮產(chǎn)，頭盆不稱。產(chǎn)前超聲檢測(cè)羊水指數(shù)（amniotic fluid index，AFI）≤5.0 cm為羊水過(guò)少，羊水指數(shù)5～9 cm為臨界性羊水過(guò)少。剖宮產(chǎn)術(shù)中進(jìn)一步核實(shí)羊水量，羊水總量＜300 m l確診為羊水過(guò)少。如果術(shù)中羊水量和術(shù)前羊水指數(shù)不相符，該病例予以剔除。

1.2 標(biāo)本采集和標(biāo)本選擇

所有研究對(duì)象行選擇性剖宮產(chǎn)后，在胎盤娩出后5 min內(nèi)立即取一份胎膜組織，然后用無(wú)菌生理鹽水漂洗干凈去除血液，置于4％的中性甲醛中固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋。

1.3 研究方法與結(jié)果

1.3.1 免疫組化方法本實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：將采集并制成的石蠟包塊標(biāo)本切成厚約5μm的切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，滴加新鮮配置的3％H2O2進(jìn)行封閉；用枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)后，分別加入稀釋的AQP9－抗兔抗人工作液（北京博奧森生物有限公司），4℃冰箱中過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗工作液，37℃孵育10 min；滴加HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min；用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，顯微鏡下觀察，控制顯色程度；淡蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。采用PBS緩沖溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判定 以鏡下在細(xì)胞內(nèi)看到棕色或黃色顆粒者作為判定陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。每張切片在高倍鏡（×400）視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察選擇視野中的所有細(xì)胞，同時(shí)記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＝陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／計(jì)算的羊膜上皮細(xì)胞數(shù)），然后計(jì)分（P）：①0分：小于5％的胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性；②1分：5％～10％的胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性；③2分：11％～50％的胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性，計(jì)；④3分：大于50％的胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性。同時(shí)對(duì)多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的棕黃色計(jì)分（I）：①3分：強(qiáng)著色；②2分：中等著色；③1分：淺著色。最終的結(jié)果為組織學(xué)積分（H）＝P＋I(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Spearman分析AQP9與Caspase3的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 AQP9及Caspase3在胎膜組織中的表達(dá)定位

AQP－9蛋白和Caspase3蛋白在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組產(chǎn)婦的胎膜中均有陽(yáng)性表達(dá)（結(jié)果見(jiàn)圖1－4）。AQP－9蛋白和Caspase3蛋白主要表達(dá)于羊膜上皮細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞，陽(yáng)性信號(hào)主要定位于胎膜細(xì)胞的胞質(zhì)中，AQP－9蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 羊水過(guò)少患者胎膜中Caspase3的表達(dá)

圖2 正常產(chǎn)婦胎膜中Caspase3的表達(dá)

圖3 羊水過(guò)少患者胎膜中AQP9的表達(dá)

圖4 正常產(chǎn)婦胎膜中AQP9的表達(dá)

2.2 AQP9、Caspase3在胎膜組織中的表達(dá)比較

羊水過(guò)少組胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞中Caspase3表達(dá)水平高于對(duì)照組，AQP9表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 胎膜細(xì)胞Caspase3、AQP8表達(dá)的組織學(xué)積分

2.3 AQP9、Caspase3在胎膜組織中的表達(dá)關(guān)系

羊水過(guò)少組胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞中AQP9與Caspase3的表達(dá)并無(wú)相關(guān)性關(guān)系，而在羊水過(guò)少組胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞中AQP9與Caspase3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.72，P＜0.05）。

3 討論

水通道蛋白（AQP）是一種膜整合蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它是一類可介導(dǎo)水分子快速被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的糖蛋白，可以通過(guò)中間的小孔介導(dǎo)大量水分子及其他小分子物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加細(xì)胞膜對(duì)水分子的通透性。它是水分子跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要分子基礎(chǔ)，保持人體細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也參與機(jī)體部分重要的生理功能。AQP除轉(zhuǎn)運(yùn)水分子外，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物質(zhì)，因此推測(cè)AQP9參與了水和其它溶質(zhì)由母體向胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，決定羊水的膜內(nèi)吸收途徑［4－5］。最近幾年有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤細(xì)胞如肺癌、白血病細(xì)胞等也存在水通道蛋白9［6－8］，缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)增加會(huì)使AQP的表達(dá)上調(diào)［9］。自Afire等在1988年發(fā)現(xiàn)水通道蛋白（AQP）后，目前在孕婦胎盤或胎膜上僅發(fā)現(xiàn)有AQP1、AQP3、AQP8和AQP9的表達(dá)［10］。AQP9除轉(zhuǎn)運(yùn)水分子外還被發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)運(yùn)嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物質(zhì)，因此推測(cè)AQP9參與了水和其它溶質(zhì)由母體向胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。國(guó)外學(xué)者在研究人類足月妊娠孕婦的胎盤胎膜時(shí)發(fā)現(xiàn)AQP9在羊膜上皮細(xì)胞、絨毛膜上皮細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外層滋養(yǎng)細(xì)胞上均有表達(dá)。

ZhuX［11－12］等在研究原發(fā)性羊水過(guò)多的病因時(shí)，發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中的AQP9的表達(dá)較正常組有明顯的升高，但是在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞上AQP9的表達(dá)卻是下降的，因此他們認(rèn)為羊水過(guò)多發(fā)生時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)代償保護(hù)機(jī)制，通過(guò)增加胎膜上AQP9的表達(dá)以達(dá)到增加羊水的膜內(nèi)吸收、減少羊膜腔內(nèi)羊水量的目的，同時(shí)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的AQP9的表達(dá)下降，導(dǎo)致母兒循環(huán)中胎盤血流量減少，羊水的生成也減少，從而共同達(dá)到減少羊水量的目的。LiuH［13－14］等也運(yùn)用RT－PCR檢測(cè)了5例羊水過(guò)多胎膜組織中AQP1、3、8、9mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)羊水過(guò)多組孕婦胎膜中發(fā)現(xiàn)有AQP9mRNA表達(dá)顯著高于正常組孕婦胎膜，同時(shí)在羊水過(guò)多組孕婦的胎盤上發(fā)現(xiàn)AQP9的表達(dá)明顯下降，但并沒(méi)有檢測(cè)比較胎盤上的表達(dá)差異。XiongZ［15］等研究了5例正常的和羊水過(guò)少孕婦的胎盤上AQP1、3、8、9mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示羊水過(guò)少組的胎盤組織中僅有AQP8mRNA表達(dá)顯著低于正常組孕婦。在之后的研究中，LiP［16］等運(yùn)用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)羊水過(guò)少組羊膜上的AQP9mRNA表達(dá)含量明顯少于羊水量正常組，并且地塞米松可能具有上調(diào)羊膜上皮細(xì)胞AQP9mRNA表達(dá)的作用，這些與Mann等的研究結(jié)果不太一致。

Caspase屬于半胱天冬蛋白酶家族中的一員，是已知的該家族成員中執(zhí)行機(jī)體細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，從而參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。Caspase3作為一種效應(yīng)Caspase，是細(xì)胞凋亡途徑中末端底物酶分解的關(guān)鍵蛋白酶，更重要的是，它是細(xì)胞凋亡蛋白酶聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。作為凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，它的表達(dá)就意味著細(xì)胞的死亡。Caspase3在正常妊娠胎膜絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的正常表達(dá)，確保正常胎膜細(xì)胞的凋亡，維持著母胎之間的物質(zhì)交換及胎兒的正常發(fā)育。正常孕婦的胎膜細(xì)胞在胎膜發(fā)育全過(guò)程中進(jìn)行有序的細(xì)胞凋亡。Simth［17］等發(fā)現(xiàn)胎膜中50％的凋亡細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡后細(xì)胞體積縮小，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞表面的水通道蛋白失活，不再介導(dǎo)水分子的跨膜運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞對(duì)羊水的通透性下降，從而導(dǎo)致妊娠羊水過(guò)少的發(fā)生。

本研究通過(guò)運(yùn)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)光鏡下AQP9蛋白和Caspase3在兩組產(chǎn)婦的胎膜細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均可見(jiàn)明顯的棕黃色染色陽(yáng)性顆粒。相對(duì)于正常妊娠組，羊水過(guò)少組胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞中AQP9蛋白的表達(dá)明顯降低；Caspase3的表達(dá)以中度及強(qiáng)陽(yáng)性為主，明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05）。由此推測(cè)，在羊水過(guò)少組的孕婦胎膜細(xì)胞上Caspase3的表達(dá)增加可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自身凋亡增加，干擾胎膜的結(jié)構(gòu)甚至功能，從而使得及引起胎膜上血管網(wǎng)形成不良，導(dǎo)致物質(zhì)交換障礙，影響體內(nèi)的水代謝及其循環(huán)，從而降低母體、胎兒及胎膜之間的羊水等物質(zhì)交換，引發(fā)羊水過(guò)少。AQP9蛋白表達(dá)下降后，一方面使得母胎液體交換、胎兒血容量及胎兒水分排泄均減少，從而減少胎兒尿液生成，導(dǎo)致羊水量的生成途徑減少。另外Caspase3的表達(dá)增加可影響胎膜上水通道蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使得AQP9的表達(dá)下降，會(huì)改變細(xì)胞對(duì)羊水的通透性，在一定程度上減少羊水膜內(nèi)途徑的重吸收，阻止過(guò)多的液體重吸收進(jìn)入胎兒血循環(huán)，從而達(dá)到平衡羊水量的目的；最后，AQP9和Caspase3在胎膜組織中的表達(dá)異常可能也是引起胎膜老化的病理分子機(jī)制之一。

羊水過(guò)少的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，它們?cè)谌四柑ンw液平衡及胎盤、胎膜羊水量的調(diào)節(jié)平衡中的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，下一步我們期望通過(guò)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多因素分析和研究，從而尋找羊水過(guò)少發(fā)生的生物學(xué)特性，進(jìn)一步揭示其發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，最終為羊水過(guò)少的早預(yù)防、早診斷和早治療提供新的研究靶點(diǎn)和方法。

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The expression of AQP9 and Caspase3 in membranes and their relatio ship w ith oligohydramnios

XIE Yan-fei，LIYing，LIHong-mei
（Department of Gynecology and Obstetrics，Yan＇an University Affiliated Hospital，Yan＇an 716000，China）

Objective To explore the event and the relationship between the expressions of AQP9 and Caspase3 in membranes of oligohydramnios and normal group.Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of AQP9 and Caspase3 in membranes from a test group（30 cases of oligohydramnios）and a control group（30 cases ofnormal pregnancy）.Results Immunohistochemistry showed the expression of AQP9 was lower in the test group than in the control，and the exp－ression of caspase3 inmembranesl trophoblastswas higher in the test group.The expression of caspase3 was inversely correlate－d with that of AQP9 in oligohydramnios（r＝－0．72，P＜0.05）.ConclusionThe expressio－ns of caspase3 and AQP9 in membranesmay play important roles in oli－gohydramnios.

oligohydramnios；membranes；AQP；caspase3；Immunohistochemistry

A

1672－2639（2014）01－0018－04

2014－01－20；責(zé)任編輯 趙菊梅］