柯 雪，董 武，白 楓，楊 琨

近年來，隨著基因工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，一種新型抗腫瘤方法——溶瘤病毒(Oncolytic viruses)療法成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，溶瘤病毒療法具有選擇性殺傷惡性腫瘤細(xì)胞、療效可靠且毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)。溶瘤病毒對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的感染力，可在惡性腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制、增殖，并溶解破壞惡性腫瘤細(xì)胞并釋放更多的病毒，感染更多的惡性腫瘤細(xì)胞，且正常細(xì)胞不受其影響，從而達(dá)到清除惡性腫瘤的治療目的[1-3]。早在20世紀(jì)初，研究者們便發(fā)現(xiàn)在接種病毒疫苗的腫瘤患者中，腫瘤出現(xiàn)自發(fā)性退化；早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)新城疫病毒和流感病毒可以使鼠腫瘤消退。經(jīng)歷了1個(gè)世紀(jì)的研究發(fā)展，溶瘤病毒載體范圍越來越大，其中包括單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒、水泡性口炎病毒 (VSV)、新城疫病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、痘苗病毒等。筆者以“ Oncolytic viruses”為關(guān)鍵詞在PubMed檢索2006—2013年發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)溶瘤病毒OncoVexGM-CSF在惡性腫瘤中的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

HSV是在基因工程中一種常用的病毒，野生型HSV分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型HSV(HSV-1)復(fù)制能力強(qiáng)、基因組大、能插入較大的基因片段、所引發(fā)的并發(fā)癥較為輕微，因此在基因治療中常被用作載體。OncoVexGM-CSF便是基于HSV-1研制的一種新型溶瘤病毒，目前被認(rèn)為是單劑量治療惡性腫瘤最具前景的溶瘤病毒[4-5]。

1 OncoVexGM-CSF的構(gòu)建

HSV-1與其他溶瘤病毒載體相比具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)能感染多種腫瘤細(xì)胞(包括人黑色素瘤細(xì)胞)；(2)復(fù)制周期短，從而產(chǎn)生更好的溶瘤作用；(3)能夠整合1種或多種外源基因，從而增強(qiáng)其抗瘤作用；(4)已被廣大臨床研究機(jī)構(gòu)接受和運(yùn)用[6]。對(duì)HSV-1的研究始于轉(zhuǎn)基因溶瘤性HSV G207[7]，研究者將G207用于惡性腦膠質(zhì)瘤的治療并取得了滿意效果，從而開始了HSV-1應(yīng)用于惡性腫瘤治療的一系列研究。第二代HSV-1產(chǎn)品G47△改良自G207，已證實(shí)其在膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌及前列腺癌中均有明顯的治療作用[8-11]。

OncoVexGM-CSF由HSV-1的JS1菌種構(gòu)建，剔除了HSV-1中的ICP34.5和ICP47基因，并將人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)整合插入到了ICP34.5位點(diǎn)，是一種加入了免疫調(diào)控因子GM-CSF的新型溶瘤病毒。因此，又稱之JS1/ICP34.5/ICP47-/GM-CSF，其構(gòu)建原理見表1。

ICP34.5基因是一種和神經(jīng)毒性相關(guān)的基因，剔除ICP34.5基因后HSV-1失去了神經(jīng)毒活性并能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中快速復(fù)制[12-13]。剔除ICP34.5基因的HSV-1能選擇性地在腫瘤細(xì)胞復(fù)制，其作用機(jī)制在于腫瘤細(xì)胞高表達(dá)DNA復(fù)制修復(fù)蛋白和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，導(dǎo)致病毒在無ICP34.5基因的情況下在腫瘤細(xì)胞內(nèi)正常復(fù)制[14]，而在正常的真核細(xì)胞，病毒復(fù)制依賴于PCNA-ICP34.5復(fù)合體。因此，剔除ICP34.5基因后的HSV-1只能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制。ICP47基因在病毒的免疫逃逸中扮演了重要角色，其主要通過抑制抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(TAP1)和抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(TAP2)而阻止抗原遞呈作用[15]。因此，剔除ICP47基因可促進(jìn)病毒抗原遞呈作用，有利于建立特異性免疫反應(yīng)。此外，剔除ICP47基因還可增加HSV獨(dú)特型短-(US)11基因的表達(dá)，從而在不削弱腫瘤選擇性的同時(shí)促進(jìn)病毒增殖。US11基因在正常情況下由延遲型病毒啟動(dòng)子操控，剔除ICP47基因后，US11則受控于立早型ICP47啟動(dòng)子。由US11基因編碼的21 kDa RNA結(jié)合蛋白集中于胞核且具有抑制細(xì)胞蛋白激酶R(PKR)激活的作用。早期US11的表達(dá)阻斷了PKR激活過程并促進(jìn)剔除ICP34.5基因的HSV-1在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[14]。因此，剔除ICP34.5和ICP47基因的OncoVexGM-CSF可選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且免疫原性增強(qiáng)，致病性減弱。

OncoVexGM-CSF最大的特點(diǎn)是整合了人GM-CSF編碼序列，而GM-CSF是一種強(qiáng)有力的樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)募集和促成熟因子。OncoVexGM-CSF在體外對(duì)各種腫瘤細(xì)胞株的溶瘤活性已被證實(shí)。Cody等[13]在鼠腹部雙側(cè)建立了A20腫瘤模型，證實(shí)剔除ICP34.5和ICP47基因的HSV(JS1/ICP34.5-/ICP47-)只能引起注射區(qū)瘤體消失，但剔除ICP34.5和ICP47基因并同時(shí)加載了人GM-CSF(JS1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF)的HSV則能引起注射區(qū)和對(duì)側(cè)未注射區(qū)瘤體同時(shí)消失。所以，人GM-CSF對(duì)引發(fā)全身免疫反應(yīng)起決定作用。

2 OncoVexGM-CSF的溶瘤機(jī)制

在黑色素瘤體區(qū)域直接注射OncoVexGM-CSF能在局部募集GM-CSF，從而吸引成熟DC細(xì)胞吞噬瀕死的黑色素瘤細(xì)胞。因此，OncoVexGM-CSF通過兩種作用機(jī)制而發(fā)揮治療作用：(1)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接溶瘤、破壞作用及刺激DC細(xì)胞等而引發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)；(2)啟動(dòng)抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。

表1 OncoVexGM-CSF的構(gòu)建原理

Table1 The construction principle of OncoVexGM-CSF

構(gòu)建過程作用剔除ICP34.5基因使病毒喪失神經(jīng)毒活性,選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制剔除ICP47基因促進(jìn)抗原遞呈作用,增加免疫原性將人GM-CSF插入ICP34.5位點(diǎn)募集和誘導(dǎo)DC,引發(fā)全身性免疫反應(yīng)HSVTK基因完整保留并表達(dá)保持病毒對(duì)阿昔洛韋的敏感性最初劑量106PFU/ml到加強(qiáng)化劑量108PFU/ml允許HSV血清陰性患者的轉(zhuǎn)化

注：GM-CSF=粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，DC=樹突狀細(xì)胞，HSV TK=單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶，PFU=空斑形成單位；HSV=單純皰疹病毒

3 OncoVexGM-CSF的安全性和耐受性

Koga等[24]對(duì)9位放棄后續(xù)放療的神經(jīng)瘤患者進(jìn)行早期溶瘤病毒HSV 1716治療安全性評(píng)價(jià)，證實(shí)了105PFU/ml劑量的HSV 1716直接注射入瘤體并未產(chǎn)生任何毒副作用；實(shí)驗(yàn)室檢查和尸檢均證明無一例患者在瘤體注射HSV 1716后發(fā)生腦炎。而在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中，此劑量的HSV 1716也不會(huì)產(chǎn)生毒性或在非瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。研究人員正在試圖進(jìn)一步證明HSV能夠在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中生存和復(fù)制，且不會(huì)對(duì)宿主造成毒性作用[25]。對(duì)于惡性膠質(zhì)瘤，另一種溶瘤病毒HSV G207也被證實(shí)在3×109PFU/ml劑量時(shí)沒有毒副作用。

Hu等[5]對(duì)30例難治性惡性腫瘤(乳腺癌、頭頸癌、胃腸癌、惡性黑色素瘤)患者進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，13例患者分別接受了單次劑量為106、107和108PFU/ml的OncoVexGM-CSF治療，1次/1～3周，而由于HSV血清陰性患者在接受了107PFU/ml的OncoVexGM-CSF治療后出現(xiàn)了局部紅斑擴(kuò)大和炎性反應(yīng)，因此，研究者認(rèn)為單次劑量107PFU/ml為HSV血清陰性患者血清轉(zhuǎn)化為陽性前的OncoVexGM-CSF最大耐受劑量；研究者還對(duì)注射OncoVexGM-CSF后1、4、8、24、48 h注射病損區(qū)進(jìn)行刮拭，并對(duì)所取下的標(biāo)本進(jìn)行噬菌斑測(cè)定，結(jié)果表明皮膚表面均無病毒存在，提示OncoVexGM-CSF耐受性較好。在該臨床試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，單次劑量組患者的主要毒副作用為腫瘤局部反應(yīng)和低熱，且在HSV血清陰性患者中更為明顯；多劑量組患者的毒副作用主要是全身癥狀，如發(fā)熱、出汗、疲乏，也可見食欲減退、惡心、嘔吐、便秘等；研究者對(duì)2例單次劑量給藥患者和8例多劑量給藥患者進(jìn)行血液和尿液檢查，均未檢出HSV DNA，表明HSV未感染未注射區(qū)[5]。Senzer等[18]對(duì)50例不能切除的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，共有42例(85%)患者存在毒副作用，多數(shù)為全身癥狀，其中發(fā)熱26例(52%)、寒戰(zhàn)24例(48%)、疲勞16例(32%)、惡心15例(30%)、嘔吐10例(20%)、頭痛10例(20%)、呼吸困難10例(20%)；其他毒性作用則與OncoVexGM-CSF治療無關(guān)。

表2 OncoVexGM-CSF的各期臨床試驗(yàn)

注：SD=完全緩解

此外，病毒復(fù)制和腫瘤細(xì)胞增殖速度的相互作用也是溶瘤病毒治療中有待攻克的難點(diǎn)，有學(xué)者通過大量實(shí)驗(yàn)建立了兩者達(dá)到平衡的計(jì)算機(jī)模型，可以幫助選擇OncoVexGM-CSF最佳治療劑量[26]。

4 OncoVexGM-CSF的各期臨床試驗(yàn)

對(duì)OncoVexGM-CSF進(jìn)行的前期臨床前試驗(yàn)均證實(shí)了其安全性，未出現(xiàn)病毒外溢或產(chǎn)生神經(jīng)毒性，這為后期進(jìn)行更多的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2001年開始的一項(xiàng)小型臨床試驗(yàn)中，首次將ICP34.5基因缺失型HSV用于5例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治療，注射劑量為103PFU/ml，其中2例患者接受了1次注射，2例患者接受了2次注射，1例患者接受了4次注射；結(jié)果顯示，1例患者在2次注射后出現(xiàn)了瘤體變平，接受了2次及以上注射的3例患者的腫瘤都有壞死現(xiàn)象[27]，與早期對(duì)膠質(zhì)瘤患者的研究結(jié)果相似[6]。Hu等[5]對(duì)30例難治性惡性腫瘤(乳腺癌、頭頸癌、胃腸癌、惡性黑色素瘤)患者進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，將患者分為單次劑量組13例和多劑量組17例，并將OncoVexGM-CSF注射入患者表皮或皮下組織，其中單次劑量組患者分別接受106、107、108PFU/ml的OncoVexGM-CSF，多劑量組患者接受多次治療。結(jié)果顯示，患者的主要毒副作用是局部炎癥、紅斑和發(fā)熱，引起HSV血清陰性患者產(chǎn)生局部炎癥的劑量上限是107PFU/ml，多劑量組患者血清HSV轉(zhuǎn)化為陰性的劑量上限為106PFU/ml，但即使到了108PFU/ml，患者耐受性也很好；生物學(xué)活性(病毒復(fù)制、局部反應(yīng)、GM-CSF表達(dá)和HSV抗原相關(guān)的腫瘤壞死)方面，OncoVexGM-CSF1次/2～3周給藥產(chǎn)生的局部反應(yīng)較小，病毒復(fù)制速度也較快。在該試驗(yàn)中，19例患者治療后接受了活檢，其中14例患者出現(xiàn)腫瘤壞死現(xiàn)象，壞死區(qū)域都能檢測(cè)到HSV。研究者據(jù)此認(rèn)為，OncoVexGM-CSF耐受性良好，多次治療也是安全的，且抗腫瘤效果明顯?？梢哉f，Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)了OncoVexGM-CSF的安全性和生物學(xué)活性，為后續(xù)研究擬定了劑量計(jì)劃。

Senzer等[18]進(jìn)行的一項(xiàng)多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中納入了50例Ⅲc或Ⅳ期不可切除黑色素瘤患者，根據(jù)腫瘤數(shù)量和大小，OncoVexGM-CSF初始劑量為106PFU/ml，每次4 ml，3周后改為108PFU/ml，1次/2周。根據(jù)實(shí)體瘤應(yīng)答評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)，該試驗(yàn)獲得了28%(14/50)的客觀應(yīng)答(即注射區(qū)和未注射區(qū)瘤體消退)率。而腫瘤免疫治療不能忽略的一個(gè)問題是其低反應(yīng)性，該試驗(yàn)中28%的客觀反應(yīng)率高于IL-2治療的客觀反應(yīng)率(10%～15%)[28]。生存率方面，患者兩年生存率為52%(26/50)，且患者腫瘤微環(huán)境MART-1特異性T細(xì)胞數(shù)量在注射區(qū)和未注射區(qū)均升高。

對(duì)黑色素瘤最有效的溶瘤載體是可復(fù)制傳代并整合了GM-CSF的HSV-1，已證實(shí)OncoVexGM-CSF的體外溶瘤活性及在小鼠體內(nèi)的抗瘤作用，并在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證了其安全性和有效劑量?；谶@些成果，OncoVexGM-CSF對(duì)黑色素瘤的Ⅲ期試驗(yàn)正在進(jìn)行中，但具體內(nèi)容尚未報(bào)道。Ⅲ期臨床試驗(yàn)最初共納入360例黑色素瘤患者，其中對(duì)照組240例，試驗(yàn)組120例。Ⅲ期臨床試驗(yàn)與Ⅱ期臨床試驗(yàn)不同之處在于：(1)Ⅲ期臨床試驗(yàn)不僅納入Ⅲc期和Ⅳ期黑色素瘤患者，還納入了Ⅲb期黑色素瘤患者；(2)伴有廣泛內(nèi)臟損傷，轉(zhuǎn)移灶直徑>3 cm，骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到侵蝕或血清乳酸脫氫酶升高的患者被排除在外，因?yàn)棰蚱谂R床試驗(yàn)表明這些患者反應(yīng)性較差；(3)與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組必須有10%及以上的患者在至少6個(gè)月內(nèi)達(dá)到了持續(xù)的客觀應(yīng)答，才認(rèn)為該試驗(yàn)結(jié)果為陽性；(4)對(duì)照組給予GM-CSF治療而不是安慰劑，其原因在于患者更易接受和有報(bào)道認(rèn)為GM-CSF能夠延緩黑色素瘤病情發(fā)展[6]。各期臨床試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果見表2。

5 展望

溶瘤病毒療法是一種將病毒導(dǎo)入瘤體的新型惡性腫瘤治療方法，在專業(yè)領(lǐng)域，人們最為關(guān)心的還是能否將其應(yīng)用于臨床，創(chuàng)造一種微型生物學(xué)武器以特異性地殺傷瘤細(xì)胞而又不對(duì)正常組織或細(xì)胞造成損傷是腫瘤治療領(lǐng)域亟待攻克的難點(diǎn)，創(chuàng)造一種新的可復(fù)制病毒療法遠(yuǎn)比測(cè)試已有病毒載體的治療作用更迫切。早期臨床試驗(yàn)不僅證明溶瘤病毒療法是一項(xiàng)“有趣的”學(xué)術(shù)活動(dòng)，而且其具有巨大的開發(fā)前景。

OncoVexGM-CSF代表了一種操控免疫系統(tǒng)的抗癌新療法，與直接的抗瘤細(xì)胞相比更具優(yōu)越性，不需要昂貴且耗時(shí)耗力的體外疫苗制備。Ⅰ期臨床試驗(yàn)已證實(shí)了OncoVexGM-CSF的耐受性和安全性，Ⅱ期臨床試驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)不可切除的Ⅲc期及Ⅳ期黑色素瘤患者良好的客觀反應(yīng)率，Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果是目前最值得期待的，且研究者有把握此試驗(yàn)會(huì)成功。相信隨著研究的進(jìn)一步深入及問題的逐步解決，OncoVexGM-CSF治療惡性腫瘤的安全性、有效劑量、溶瘤效果在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中的進(jìn)一步驗(yàn)證，OncoVexGM-CSF在惡性腫瘤治療中的作用將是未來備受矚目的焦點(diǎn)，有可能成為惡性腫瘤治療的分水嶺。

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