孫曉娜，汪 偉，張玉峰，吳秋霞，黨中勤，牛學(xué)恩

胃癌前病變(precancerous lesions of gastric canner，PLGC)是包括慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)并伴有腸上皮化生(Intestinal metaplasia，IM)和不典型增生(atypical hyperplasia，ATP)的一種病理狀態(tài)。多項研究表明CAG伴IM和ATP與胃癌(gastric cancer，GC)的發(fā)病呈正相關(guān)，因此PLGC與GC的發(fā)生密切相關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由20～25個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[1]，已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。let-7a是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，研究顯示其與人類眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，與胃癌的生物學(xué)特性也存在密切關(guān)系[2]。本研究通過探討散瘀和胃湯對PLGC let-7a的影響，為中藥治療PLGC提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇清潔級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由河南中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)表法分為對照組(11只，空白對照)和造模組(49只)。

1.1.2 主要試劑 散瘀和胃湯由茵陳15 g、藿香15 g、佩蘭15 g、茯苓18 g、黃連6 g、半枝蓮20 g、半邊蓮20 g、全蝎3 g、白花蛇舌草25 g、丹參15 g組成，藥材購自河南省中醫(yī)院中藥房，按1∶5比例加水浸泡30 min，煮沸30 min，過濾。藥渣再次按1∶5比例加水煮沸20 min，過濾并合并2次藥液，60 ℃水浴，濃縮成1 ml相當(dāng)于原生藥材1 g的藥液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 所有大鼠食用顆粒性飼料，飲用自來水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用限期飲水給藥法建立大鼠PLGC模型，對照組給予正常飲食，造模組每日將新鮮配制濃度為100 g/L的甲基硝基亞硝基胍(MNNG)飲用液供大鼠飲用，連續(xù)24周，并隨機(jī)抽取5只大鼠做病理學(xué)檢測以確定造模情況，造模成功后隨機(jī)分為模型組、散瘀和胃湯高劑量治療組(11.50 g·kg-1·d-1，高劑量組)、散瘀和胃湯中劑量治療組(5.55 g·kg-1·d-1，中劑量組)、散瘀和胃湯低劑量治療組(2.75 g·kg-1·d-1，低劑量組)，每組11只。第12周末處死各組大鼠，選取同一部位將胃沿大彎側(cè)打開，光鏡下觀察胃黏膜病理組織學(xué)改變，計數(shù)各組淺表性胃炎(CSG)、CAG、IM、ATP的發(fā)生情況，其中CAG+IM和CAG+ATP均屬于PLGC。

1.2.2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀為美國ABI公司的ABI7000；反轉(zhuǎn)錄引物參照Caifu Chen等進(jìn)行設(shè)計，熒光PCR引物及探針使用Primer Express軟件(ABI)設(shè)計，標(biāo)準(zhǔn)品(let-7aSeq)為人工合成let-7a miRNA模板。核酸合成均在上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行。Super ScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司，其他PCR試劑均為Promega公司產(chǎn)品。

1.2.3 基因檢測

1.2.3.1 總RNA提取 胃癌組織及相應(yīng)正常胃黏膜組織總RNA提取采用TRIzol試劑；嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。提取的總RNA應(yīng)用紫外分光光度計、根據(jù)A260進(jìn)行定量。將正常胃黏膜組織總RNA定量至5 μg，然后依次稀釋至500.000、50.000、5.000、0.500、0.050、0.005 ng共7個梯度。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 10 μl總RNA或人工合成let-7a miRNA模板于70 ℃變性10 min后立即冰??；加入50 ng/μl反轉(zhuǎn)錄引物let-7a PRT 1.0 μl，10 mmol/L dNTP 1.0 μl，5×RT buffer 4.0 μl，Super ScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，反應(yīng)體系為20 μl，室溫10 min，42 ℃保溫45 min，85 ℃保溫5 min，4 ℃保溫5 min。

1.2.3.3 PCR 取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5.0 μl，按以下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增:5.0 μl 10×PCR buffer，5.0 μl 25 mmol/L Mg2+，1.0 μl 10 mmol/L dNTP，上下游引物(let-7aP，f let-7aPr)各50 pmol，MGB探針(let-7aT)10.0 pmol，5 U/μl Taq酶1.0 μl，反應(yīng)體系為50 μl，循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性10 min、94 ℃變性15 s、62 ℃退火1 min，擴(kuò)增40個循環(huán)后觀察分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 let-7a相對表達(dá)量比較 各組的let-7a相對表達(dá)量分別為：對照組(0.626±0.102)、模型組(0.291±0.097)、低劑量組(0.326±0.108)、中劑量組(0.494±0.144)、高劑量組(0.623±0.098)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.377，P=0.001)。其中對照組let-7a相對表達(dá)量較模型組、低劑量組、中劑量組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.857、6.706、2.457，P<0.05)；模型組較中劑量組、高劑量組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.854、-7.959，P<0.01)；低劑量組較中劑量組、高劑量組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.101、-6.777，P<0.01)；中劑量組較高劑量組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.452，P<0.05)。

2.2 光鏡下各組胃黏膜病理組織學(xué)改變情況及PLGC發(fā)生率比較 各組CSG、CAG、CAG伴IM、CAG伴ATP的發(fā)生例數(shù)詳見表1，其中后兩項屬于PLGC。各組PLGC發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.734，P=0.000)。其中模型組PLGC發(fā)生率較中劑量組和高劑量組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.90，P<0.05；χ2=10.29，P<0.05)。

表1 光鏡下各組胃黏膜病理組織學(xué)改變情況及PLGC發(fā)生率比較

Table1 Comparison of histopathological change of gastric mucosa and the incidence rate of PLGC in each group

組別只數(shù)CSGCAGCAG+IMCAG+ATPPLGC發(fā)生率對照組11110000模型組11015510/11低劑量組1122437/11中劑量組1152224/11高劑量組1162213/11

注：CSG=淺表性胃炎，CAG=慢性萎縮性胃炎，CAG+IM=慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生，CAG+ATP=慢性萎縮性胃炎伴不典型增生，PLGC=胃癌前病變

3 討論

CAG是最常見的胃癌前狀態(tài)，Sipponen等[3]證實了50%～90%的胃癌患者伴有CAG，CAG演變成胃癌的發(fā)生率約為10%。CAG的主要病理特征為黏膜慢性炎癥和腺體萎縮，CAG伴有胃黏膜IM和ATP定義為PLGC。國內(nèi)外許多研究者致力于尋找延緩和逆轉(zhuǎn)腺體萎縮、腸化、異性增生的方法，但未取得突破性進(jìn)展。中醫(yī)藥具有辨證論治、個體化、方藥隨證加減等特點(diǎn)，為治療CAG及PLGC積累了許多經(jīng)驗。

PLGC多因先天脾胃虛弱，長期、反復(fù)的飲食不節(jié)，情志所傷，外邪犯胃，導(dǎo)致氣機(jī)郁滯、脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)阻、熱毒蘊(yùn)結(jié)、瘀血停滯、陰液虧虛，而熱毒和血瘀是本病病機(jī)演變所在?！岸緸闊嶂畼O，熱為毒之漸”。陰傷源于熱毒，氣滯日久必見血瘀。有學(xué)者采用散瘀和胃湯辨證加減治療CAG伴IM患者52例，總有效率94%，能明顯改善胃黏膜充血、糜爛、白象、粗糙，逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮和腸化[4]。散瘀和胃湯方中藿香、丹參，散瘀和胃，為君藥，《本草圖經(jīng)》謂藿香“治脾胃吐逆，為最要之藥”。臣以佩蘭、茯苓化濕和胃，和中定痛，活血化瘀。以茵陳、半枝蓮、白花蛇舌草、黃連清熱解毒散瘀共為佐使。全蝎攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛，諸藥合用共奏化濁解毒、活血化瘀之功。現(xiàn)代藥物研究表明，藿香可抑制腸管痙攣性收縮及內(nèi)臟絞痛，增加胃酸分泌，提高胃蛋白酶活性，調(diào)節(jié)免疫力[5]。佩蘭[6]、茯苓[7]具有增強(qiáng)免疫力、抗感染及抗腫瘤作用。茵陳[8]、黃連[9]、白花蛇舌草[10]、半枝蓮[11]、半邊蓮[12]具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞作用。丹參能夠改善血液微循環(huán)，促進(jìn)組織修復(fù)與再生，具有抗感染及抗腫瘤作用[13]。

miRNA是一類由20～25個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，具有調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的功能[1]，并與對化放療的敏感性[14]、復(fù)發(fā)率[15]及耐藥[16]等密切相關(guān)。miRNA與腫瘤關(guān)系的研究成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，最近對胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA與胃癌的生物學(xué)特性存在密切關(guān)系。Chan等[17]用RT-PCR技術(shù)對37例胃癌組織與正常組織中的miR-21的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，探討miR-21與臨床病理因素間的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-21在胃癌組織中過度表達(dá)，但與胃癌患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性。Zhang等[18]在細(xì)胞研究中證實了miR-21的過度表達(dá)能夠促使細(xì)胞增殖、移動和停止細(xì)胞凋亡。通常認(rèn)為胃癌的傳統(tǒng)發(fā)生途徑為：CSG→CAG→IM→ATP→胃癌。在與胃黏膜炎癥、PLGC和胃癌有關(guān)的miRNAs微點(diǎn)陣分析中，Petrocca等[19]發(fā)現(xiàn)了具有正向調(diào)節(jié)作用的miR-106b、miR-25和miR-93，證實了miR-106b、miR-25和miR-93改變胃癌細(xì)胞對TGF-β的生理應(yīng)答，影響了細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。Xiao等[20]認(rèn)為miR-155在幽門螺桿菌感染的胃上皮細(xì)胞及胃黏膜組織中表達(dá)增多，miR-155的過度表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)IL-8釋放和增殖相關(guān)的癌基因SMAD2(Sma and Mad-related protein 2)，miR-155的過度表達(dá)明顯減少了幽門螺桿菌感染所引起的IL-8的產(chǎn)生，證實miR-155通過靶向調(diào)節(jié)炎癥途徑中的關(guān)鍵分子MyD88而負(fù)向調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，而筆者未見散瘀和胃湯對PLGC let-7a影響的相關(guān)研究文獻(xiàn)。

本研究通過對癌前病變大鼠胃黏膜組織miRNA進(jìn)行檢測，觀察活血散瘀湯對PLGC大鼠胃黏膜組織let-7a的影響，研究結(jié)果顯示，let-7a在PLGC中呈低表達(dá)。中、高劑量散瘀和胃湯能夠提高let-7a的表達(dá)量，并且減少PLGC發(fā)生率，因此散瘀和胃湯可能通過增高胃黏膜組織miRNA的表達(dá)量而防止癌變。今后將進(jìn)一步通過免疫組化及western blot等技術(shù)驗證let-7a相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，為確定let-7a在胃癌中的靶向調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)，為利用散瘀和胃湯治療CAG及PLGC提供更加充分的理論依據(jù)。

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