蔡華珠 湯慧敏 于曉艷 洪虹雅 陳超云 劉啟鴻

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福州350122）

巳時(shí)、申時(shí)健脾益智膠囊對(duì)AD大鼠全血AChE表達(dá)的影響※

蔡華珠1湯慧敏1于曉艷1洪虹雅1陳超云2劉啟鴻1

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福州350122）

目的探討巳時(shí)、申時(shí)健脾益智膠囊對(duì)老年性癡呆（AD）大鼠全血乙酰膽堿酯酶（AChE）表達(dá)的影響，揭示“脾主巳時(shí)”理論的科學(xué)性。方法通過(guò)腹腔注射D-半乳糖，同時(shí)胃飼氯化鋁（ALCL3）的方法塑造AD動(dòng)物模型，設(shè)立正常對(duì)照組、模型組、中藥申時(shí)組、中藥巳時(shí)組，應(yīng)用分光光度測(cè)定方法測(cè)TChE活性，通過(guò)比較巳時(shí)和申時(shí)健脾益智膠囊對(duì)AD大鼠全血中AChE表達(dá)的影響來(lái)揭示“脾主巳時(shí)”的科學(xué)性。結(jié)果AD大鼠經(jīng)過(guò)治療，中藥巳時(shí)組AChE活性明顯降低，與模型組和中藥申時(shí)組比較有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論健脾益智膠囊可以降低全血AChE活性，起到治療AD的作用，而中藥巳時(shí)組效果顯著，從而驗(yàn)證“脾主巳時(shí)”理論的科學(xué)性。

脾；巳時(shí)；申時(shí)；阿爾茨海默??；乙酰膽堿酯酶；健脾益智膠囊

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣血在十二經(jīng)脈的運(yùn)行具有晝夜節(jié)律性，十二經(jīng)脈氣血的運(yùn)行與十二時(shí)辰相應(yīng)，每一經(jīng)脈的氣血旺盛于其相應(yīng)的時(shí)辰，如足太陰脾經(jīng)旺于巳時(shí)（上午9點(diǎn)到11點(diǎn)）。老年性癡呆(Altheimer's disease，AD)的基本病機(jī)為髓減腦消，髓由精所化，而脾為“后天之本”，“氣血生化之源”。從2000年開(kāi)始，研究人員不斷對(duì)中藥制劑健脾益智膠囊治療老年性癡呆進(jìn)行了相關(guān)理論、臨床和實(shí)驗(yàn)研究，成效顯著[1-2]。

本研究主要通過(guò)巳時(shí)、申時(shí)對(duì)老年性癡呆大鼠（AD）給健脾益智膠囊，應(yīng)用分光光度測(cè)定的方法測(cè)定AD大鼠全血乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase，TChE）活性的變化，揭示“脾主巳時(shí)”理論的科學(xué)性?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)研究部分進(jìn)行分析討論。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及其分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)40周齡SD雄性大鼠60只，體重500±10g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證SCXK(京)2012-0001，實(shí)動(dòng)單項(xiàng)準(zhǔn)11400700020031號(hào)。動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證書(shū)為醫(yī)動(dòng)字第23-016號(hào)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、中藥巳時(shí)組、中藥申時(shí)組，每組15只。

隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、中藥巳時(shí)組、中藥申時(shí)組，每組15只。

1.2 藥品、試劑和儀器氯化鋁（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司提供，批號(hào)：F20130628）；分析純；D一半乳糖（上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20130613）；健脾益智膠囊（福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂）；AChE測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所,批號(hào):20130821）；多功能酶標(biāo)儀（TECAN Infinite M200）。

1.3 藥物配制及給藥健脾益智膠囊由人參、黃芪、水蛭、石菖蒲、遠(yuǎn)志等加工制成。大鼠給藥劑量按《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》所提供的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等效劑量換算比率表”倍數(shù)折算。用蒸餾水將其制備成0.2 g/m L濃度的強(qiáng)脾益智膠囊混懸液給藥給中藥巳時(shí)組和中藥申時(shí)組大鼠；模型組，中藥巳時(shí)組和中藥申時(shí)組每日腹腔注射濃度為4.8mg/mL的D-半乳糖，按1ml/0.1kg·d劑量，同時(shí)胃飼濃度為20 mg/mL的ALCL3，按lmL/0.1kg·d劑量，塑造AD動(dòng)物模型，持續(xù)30天。中藥巳時(shí)組、中藥申時(shí)組均從實(shí)驗(yàn)第31天開(kāi)始給藥，連續(xù)7天。

1.4 標(biāo)本的采集與制備造模第30天和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠均進(jìn)行斷尾，用定量采血10ul后，立即注入含有990 uL生理鹽水的試管中(即按1：99稀釋)，大鼠尾部壓迫止血，所采血液冰箱低溫(4℃)儲(chǔ)存待測(cè)全血中AChE活力水平。

1.5 AChE活性的測(cè)定AChE水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應(yīng)生成對(duì)稱(chēng)三硝基苯（TNB）黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反應(yīng)膽堿酯酶的活力，計(jì)算出AChE的活力，具體操作參照AChE測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模第31天和給藥第8天4組大鼠全血AChE的活性比較見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠全血中AChE活性比較

表1 4組大鼠全血中AChE活性比較

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2)P＜0.01，3)P＜0.05；與西藥組比較，4)P＜0.05

組別例數(shù)造模第30天AChE活性(U·ml-1)中藥巳時(shí)組1556.03±6.111)中藥申時(shí)組1554.94±13.861）模型組1556.14±3.451）正常對(duì)照組1533.30±6.22 8例數(shù)1 091 0給藥第8天AChE活性(U·ml-1) 34.27±1.702)4）42.59±4.612)61.36±13.221）58.14±3.433）

3 討論

自然界的一切生物不僅具有適應(yīng)自然的生理結(jié)構(gòu)和生理機(jī)制，還具有適應(yīng)自然環(huán)境的節(jié)律變化(季節(jié)、晝夜、時(shí)辰)而形成的高度時(shí)間節(jié)律的生物活動(dòng)特性[3]。中醫(yī)學(xué)是最早認(rèn)識(shí)和應(yīng)用這種特性的學(xué)科之一，如其中的子午流注學(xué)說(shuō)便是很好的例證。子午流注學(xué)說(shuō)將人體氣血運(yùn)行比喻為水流，從子時(shí)到午時(shí)，隨時(shí)間先后順序，人體陰陽(yáng)盛衰，營(yíng)衛(wèi)運(yùn)行，經(jīng)脈流注，時(shí)穴開(kāi)闔，均與自然界具有同步的節(jié)律變化，如巳時(shí)(上午9～11時(shí))流經(jīng)脾經(jīng)；申時(shí)(下午15～17時(shí))流注膀胱經(jīng)。該學(xué)說(shuō)指出：氣血迎時(shí)而至為盛，過(guò)時(shí)而去為衰；逢時(shí)為開(kāi)，過(guò)時(shí)為闔；定時(shí)開(kāi)穴或給藥，方可有效地調(diào)和陰陽(yáng)，糾正機(jī)體的偏勝偏衰[4]。根據(jù)此學(xué)說(shuō)可知“脾”應(yīng)“巳時(shí)”。

脾藏意主思，與情志密切相關(guān)，而大腦主要功能是主導(dǎo)運(yùn)動(dòng)、感受、意識(shí)、思維、記憶、情緒等，其主司精神、意識(shí)、思維和情感活動(dòng)可歸屬于中醫(yī)情志范疇。因此中醫(yī)脾胃與大腦存在密切的相關(guān)性。

基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失嚴(yán)重為AD主要病理改變之一。中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)是乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)，它由膽堿乙酰化轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransterase，CHAT)催化合成，AChE催化分解。AD患者腦組織中Ach含量明顯減少，而合成Ach的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CHAT)活性降低，分解Ach的AChE活性明顯增高，從而使Ach含量明顯減少。

本研究結(jié)果提示，健脾益智膠囊可以降低全血AChE的活性，保護(hù)Ach這一中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，從而達(dá)到治療AD的作用。而中藥巳時(shí)組大鼠全血中AChE活性較中藥申時(shí)組下降更為突出。由此可說(shuō)明某一臟腑經(jīng)絡(luò)的疾病，在不同時(shí)間給藥療效是不一致的。正如王冰所說(shuō)：“藏在內(nèi)，其象在外可閱者也?！北緦?shí)驗(yàn)通過(guò)這種“天人相應(yīng)”觀指導(dǎo)下的“以時(shí)測(cè)臟”的思路確切地證實(shí)脾經(jīng)氣血旺盛于巳時(shí)，以及在脾臟功能活躍之時(shí)，“因時(shí)制宜”對(duì)AD進(jìn)行治療可取得顯著的療效。因此依臟腑相應(yīng)之時(shí)用藥很有必要進(jìn)行深入挖掘研究，以完善中醫(yī)學(xué)“時(shí)臟相應(yīng)”的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵及臨床運(yùn)用。

[1]蔡華珠，紀(jì)立金.強(qiáng)脾益智膠囊對(duì)老年性癡呆大鼠腦海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009，19(6):57-58.

[2]馮珂，紀(jì)立金.健脾益智膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖及Notchl、Jaggedl表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013，28(4):921-924.

[3]李財(cái).中藥制劑給藥時(shí)間的探討[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2005，3（6）：45-46.

[4]郭霞珍.劉曉燕.馬淑然.“以時(shí)測(cè)臟”理論的分析和探討[J].中醫(yī)雜志，2006，47（2）:85-87.

Effects of Jianpi Yizhi Capsule on Whole Blood AChE in Rats with Alzheimer Disease During 9～11 am and 3～5pm

Cai Huazhu1Tang Huimin1Yu Xiaoyan1Hong hongya1Chen Chaoyun2Liu Qihong1
(1 Fujian university of traditional Chinese medicine,Fuzhou350122,China; 2 Orthopedics Institute of Fujian university of traditional Chinese medicine,Fuzhou350122,China)

Obejective To detect the effects of Jianpi Yizhi Capsule on the whole blood AChE in the rats with Alzheimer Disease during 9~ 11 am and 3~5pm and reveal the scientific theory of"Spleen in 9~11am".Methods The AD racts model was established by D(+) Galactose injected into the rats and intragastric administration of ALCL3,the rats were divided into 4 groups,the control group,the model group,the chinese herbal medicine Si-shi group,the chinese herbal medicine Shen-shi group,Spectrophotometric method was used to measure the whole blood of AChE activity,by comparing the expression of Jianpi Yizhi Capsule on the whole blood AChE in the rats with alzheimer disease during Si-shi(9~11am)9~11 am and Shen-shi(3~5pm)to reveal the scientific theory of"Spleen in Si-shi(9~ 11am)".Results After the treatmeat of AD rats,the AChE activity of the chinese herbal medicine Si-shi group was significantly reduced, compared with that of the model group and the chinese herbal medicine Shen-shi group,it had highly significant difference(P＜0.05 or P＜0.01）).Conclusion The Jianpi Yizhi Capsule can reduce the whole blood of AChE activity,it had the therapeutic effect on AD,and the Chinese herbal medicine Si-shi group had significant effect,that verified the scientific theory of"Spleen in 9~11am".

spleen;Si-shi(9~11am);Shen-shi(3~5pm);alzheimer disease;AChE;Jianpi Yizhi Capsule

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.24.087

1672-2779（2014）-24-0153-02

楊杰 本文校對(duì)：鄭春松

2014-12-02）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[No：81202613]；福建省教育廳B類(lèi)課題[No：JB08158]；福建省大學(xué)生創(chuàng)新課題[No：201310393037]