崔 巖，栗紅蕊，孫高潔，王 姣，王守?。ㄠ嵵荽髮W第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科，鄭州 450052）

利拉魯肽對肥胖大鼠體質(zhì)量、血脂水平和下丘腦炎癥通路的影響研究

崔 巖＊，栗紅蕊，孫高潔，王 姣，王守俊#（鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科，鄭州 450052）

目的：研究利拉魯肽對肥胖大鼠體質(zhì)量和血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平及下丘腦炎癥通路的影響。方法：取大鼠分別用基礎(chǔ)飼料和高脂飼料喂養(yǎng)8周后，分為正常對照組、肥胖組、肥胖-利拉魯肽組。正常對照組和肥胖組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，肥胖-利拉魯肽組大鼠腹腔注射利拉魯肽100μg/kg，每日2次，連續(xù)8周。末次給藥后隔夜禁食處死大鼠，稱體質(zhì)量，檢測各組大鼠給藥前和末次給藥后血清中TC、TG水平和下丘腦細胞核因子κB（NF-κB）mRNA及細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3（SOCS-3）蛋白的表達。結(jié)果：與正常對照組比較，肥胖組大鼠體質(zhì)量和血清中TC、TG水平及下丘腦NF-κB mRNA、SOCS-3蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與肥胖組比較，肥胖-利拉魯肽組大鼠體質(zhì)量和血清中TC、TG水平及下丘腦NF-κB mRNA、SOCS-3蛋白表達水平均較明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論：利拉魯肽能顯著改善高脂誘導肥胖大鼠的體質(zhì)量增加、血脂紊亂，其機制可能涉及下丘腦炎癥調(diào)節(jié)通路的改善。

利拉魯肽；肥胖；大鼠；下丘腦；細胞核因子κB；細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3

＊碩士研究生。研究方向：肥胖與炎癥的關(guān)系。電話：0371-66295062。E-mail：370482686@qq.com

#通信作者：主任醫(yī)師，博士。研究方向：糖尿病的發(fā)病機制及防治。電話：0371-66295062。E-mail：wangshoujun02@126.com

近年來肥胖的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)成為世界范圍的公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖不僅是脂肪的過度積累，而且與2型糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓和脂肪肝等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其帶來的心理社會問題也不容忽視[2]。因此，探索安全、有效、耐受性好、能夠降低肥胖相關(guān)疾病風險的藥物具有重要意義。新型降糖藥物利拉魯肽是一種胰高血糖素樣肽1（GLP-1）受體激動藥，其不僅具有葡萄糖濃度依賴性促進胰島素釋放、保護胰島β細胞的功能[3]，也具有抑制食欲及攝食、減輕體質(zhì)量等作用，提示利拉魯肽也可能使肥胖者受益[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與炎癥反應密切相關(guān)，表現(xiàn)為系統(tǒng)性的慢性低度炎癥狀態(tài)[5]。研究表明，基因型和高脂飲食誘導的肥胖大鼠下丘腦炎性反應較正常大鼠均明顯增強，伴隨中樞胰島素抵抗，提示作為機體攝食及能量平衡的調(diào)控中樞，抑制下丘腦炎癥信號通路對肥胖及其他代謝綜合征的治療具有重要意義[6-7]。Parthsarathy V等[8]發(fā)現(xiàn)利拉魯肽具有神經(jīng)系統(tǒng)保護作用，能夠減輕阿爾茨海默病模型大鼠下丘腦中慢性炎癥反應。郭南京等[9]研究也表明，利拉魯肽可顯著改善OLETF（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty）模型大鼠血清炎癥指標。本實驗應用利拉魯肽對高脂喂養(yǎng)建立的肥胖大鼠模型進行干預，觀察利拉魯肽對肥胖大鼠體質(zhì)量和血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平及下丘腦炎癥細胞核因子κB（NF-κB）mRNA及細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3（SOCS-3）蛋白的影響。

1 材料

1.1 儀器

－80℃低溫冰箱（日本Sanyo公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；美國UVP凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀和電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

利拉魯肽注射液（丹麥諾和諾德制藥公司，批號：DP50185，規(guī)格：3m l∶18mg）；基礎(chǔ)飼料和高脂飼料（河南省動物實驗中心）；Trizol新型總RNA抽提試劑[寶生物工程（大連）有限公司]；反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司）；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；兔抗大鼠SOCS-3抗體（美國Cell signaling technology公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（北京博奧森公司）；辣根過氧化物酶標記二抗（美國Bio-rad公司）；大鼠TG、TC酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國RD公司）。

1.3 動物

5周齡健康清潔級SD大鼠48只，♂，體質(zhì)量130～160 g，由河南省動物實驗中心提供，使用許可證號：SCXK（豫）2010-0002。

2 方法

2.1 建模與分組[10-12]

將48只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機數(shù)字表法分為基礎(chǔ)飼料組（n＝8）和高脂飼料組（n＝40）喂養(yǎng)8周。以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的大鼠為正常對照組，將體質(zhì)量大于正常對照組大鼠平均體質(zhì)量+1.96倍標準差的高脂飼料喂養(yǎng)大鼠分為肥胖組和肥胖-利拉魯肽組。正常對照組和肥胖組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），肥胖-利拉魯肽組大鼠腹腔注射利拉魯肽100μg/kg[10]，每日2次，連續(xù)8周。

2.2 標本采集

于實驗前和實驗開始第8、16周，觀察各組大鼠活動、飲食情況和體質(zhì)量。

于實驗開始第8周末，各組大鼠過夜禁食12 h采集尾血，靜置2 h，4℃、3 000 r/m in（離心半徑100mm）離心15m in，分離血清，－80℃保存待測。16周末，各組大鼠隔夜禁食12 h后斷頭處死，收集全血，分離血清，－80℃保存；迅速分離下丘腦組織并置液氮凍存，待測。

2.3 ELISA法檢測血清中TC、TG水平

采用ELISA法檢測各組大鼠血清中TC、TG水平，步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作，每組設置3個復孔。

2.4 下丘腦中NF-κBm RNA檢測

取各組大鼠下丘腦組織約50mg，采用Trizol法提取下丘腦總RNA，檢測RNA濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行PCR反應。上下游引物分別為β-actin：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′、5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，擴增片段長度349 bp；NF-κB：5′-GAGAGCCCTTGCATCCTTTA-3′、5′-CTTCCCTTTGGTCTTTCTGT-3′，擴增片段長度100 bp。NF-κB基因擴增條件為：94℃預變性5 m in；94℃變性30 s，56.4℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)；72℃10m in。擴增產(chǎn)物均進行2%瓊脂糖凝膠電泳成像，目的條帶與β-actin條帶吸光度比值進行NF-κBmRNA表達半定量結(jié)果分析。

2.5 下丘腦中SOCS-3蛋白檢測

配制裂解液為苯甲基磺酰氟（PMSF）-細胞組織快速裂解液（RIPA）（1∶99，現(xiàn)用現(xiàn)配）。取各組大鼠下丘腦組織50mg，加入500μl裂解液，置于高通量組織勻漿機勻漿，冰浴靜置15 m in后取上清，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。取待測蛋白樣品37.5μg，100℃5min使蛋白變性，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠SOCS-3抗體，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，Image Studio Ver2.0軟件測灰度值，計算其與β-actin的比值。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)均以±s表示。兩獨立樣本比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 基本情況

實驗過程中，正常對照組大鼠活動好，飲食正常；肥胖組食欲旺盛，肥胖-利拉魯肽組較肥胖組攝食減少，兩組大鼠活動量均減少；至實驗結(jié)束時未有大鼠死亡。

3.2 指標結(jié)果

實驗前，基礎(chǔ)飼料組與高脂飼料組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗開始8周末，將高脂飼料組大鼠中17只體質(zhì)量是基礎(chǔ)飼料組平均體質(zhì)量+1.96倍標準差的大鼠分為肥胖組，肥胖發(fā)生率為42.5%。與基礎(chǔ)飼料組比較，肥胖組大鼠體質(zhì)量和血清中TC、TG水平均明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 大鼠不同時間體質(zhì)量和血清中TC、TG水平比較（±s）Tab 1 Com parison of body weight and serum level of TC and TG atdifferent time（±s）

表1 大鼠不同時間體質(zhì)量和血清中TC、TG水平比較（±s）Tab 1 Com parison of body weight and serum level of TC and TG atdifferent time（±s）

與基礎(chǔ)飼料組比較：＊P＜0.01vs.normal controlgroup：＊P＜0.01

時間第0周n8 TC，mmol/L TG，mmol/L 0.755±0.077 1.090±0.095＊第8周組別基礎(chǔ)飼料組高脂飼料組基礎(chǔ)飼料組肥胖組40 8 17體質(zhì)量，g 168.75±7.025 165.58±12.926 379.63±17.171 430.94±10.662＊1.48±0.10 2.84±0.20＊

16周末，與正常對照組比較，肥胖組和肥胖-利拉魯肽組大鼠體質(zhì)量和TC、TG水平均明顯升高（P＜0.01）；與肥胖組比較，肥胖-利拉魯肽組大鼠體質(zhì)量和TC、TG水平均明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 大鼠給藥后體質(zhì)量和血清中TC、TG水平比較（±s）Tab 2 Comparison of body weight and serum level of TC and TG aftermedicatio（n±s）

表2 大鼠給藥后體質(zhì)量和血清中TC、TG水平比較（±s）Tab 2 Comparison of body weight and serum level of TC and TG aftermedicatio（n±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與肥胖組比較：#P＜0.01vs.normal controlgroup：＊P＜0.01；vs.obesity group：#P＜0.01

組別正常對照組肥胖組肥胖-利拉魯肽組TG，mmol/L 0.885±0.098 1.370±0.096＊0.993±0.076＊# n889體質(zhì)量，g 505.50±11.686 546.00±10.677＊525.63±8.815＊# TC，mmol/L 1.56±0.09 3.35±0.18＊1.90±0.18＊#

3.3 下丘腦中NF-κBm RNA和SOCS-3蛋白表達

與正常對照組比較，肥胖組大鼠下丘腦中NF-κBmRNA和SOCS-3蛋白表達均明顯升高（P＜0.01）；與肥胖組比較，肥胖-利拉魯肽組大鼠下丘腦中NF-κBmRNA和SOCS-3蛋白表達均明顯降低（P＜0.01），電泳圖見圖1，結(jié)果見表3。

圖1 大鼠下丘腦中NF-κBm RNA和SOCS-3蛋白表達電泳圖Fig 1 Electrophoregram of the expression of NF-κB m RNA and SOCS-3 protein in hypothalamusof rats

表3 大鼠下丘腦中NF-κBmRNA及SOCS-3蛋白表達灰度值比較（±s）Tab 3 Com parison of the expression of NF-κB m RNA and SOCS-3 protein in hypothalamusof rat（±s）

表3 大鼠下丘腦中NF-κBmRNA及SOCS-3蛋白表達灰度值比較（±s）Tab 3 Com parison of the expression of NF-κB m RNA and SOCS-3 protein in hypothalamusof rat（±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與肥胖組比較：#P＜0.01vs.normalcontrolgroup：＊P＜0.01；vs.obesity group：#P＜0.01

組別正常對照組肥胖組肥胖-利拉魯肽組SOCS-3/β-actin 0.103±0.021 0.569±0.031＊0.228±0.032# n889 NF-κB/β-actin 0.151±0.061 0.591±0.048＊0.375±0.031#

4 討論

肥胖是機體脂肪堆積過多和（或）分布異常、體質(zhì)量增加，是包括遺傳、環(huán)境、心理因素等多種因素相互作用引起的慢性代謝性疾病。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)肥胖個體通常伴隨著炎性因子分泌的增加，呈現(xiàn)慢性低度炎癥狀態(tài)[5]，IKKβ/NF-κB通路的激活發(fā)揮著重要的作用[13]。作為肥胖發(fā)生重要危險因素的高脂飲食可以與免疫系統(tǒng)交互作用，導致肥胖及相關(guān)代謝綜合征炎性反應的發(fā)生。

GLP-1是腸道L細胞在進食后分泌的一種重要的肽類激素，具有優(yōu)異的糖調(diào)節(jié)功能，在糖尿病治療方面具有廣闊的應用前景[14]。目前關(guān)于GLP-1能否緩解肥胖狀態(tài)下丘腦炎癥反應的研究較少，故本文研究了GLP-1長效類似物利拉魯肽對肥胖大鼠體質(zhì)量和血清中TC、TG及下丘腦炎癥通路的影響。

下丘腦能夠整合多種神經(jīng)、內(nèi)分泌、營養(yǎng)有關(guān)的信號，在調(diào)節(jié)代謝和維持能量平衡方面均具有重要功能[15]。肥胖狀態(tài)下IKKβ/NF-κB通路的激活和SOCS-3等相關(guān)因子表達顯著增加[16]，可抑制下丘腦神經(jīng)核團內(nèi)胰島素和瘦素信號轉(zhuǎn)導，影響神經(jīng)肽γ等多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌及交感神經(jīng)活性，引起食欲增加及機體能量消耗減少，從而加劇肥胖和相關(guān)代謝性疾病的發(fā)展[17]。而H?lscher C等[18]的研究表明，GLP-1能夠穿過血腦屏障，其受體廣泛分布于下丘腦，具有神經(jīng)保護作用，可促進神經(jīng)元的發(fā)生，抑制凋亡和氧化應激，減少退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)元內(nèi)空斑形成和慢性炎癥反應。

本實驗結(jié)果表明，利拉魯肽能顯著改善高脂誘導肥胖大鼠體質(zhì)量增加、血脂紊亂，其機制可能涉及下丘腦炎癥調(diào)節(jié)通路的改善。

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Effects of Liraglutide on Body Weight，Serum Lipid and Hypothalam ic Inflamm atory Pathway in Obese Rats

CUIYan，LIHong-rui，SUN Gao-jie，WANG Jiao，WANG Shou-jun（Dept.of Endocrinology and Metabolic Disease，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

OBJECTIVE：To study the effects of liraglutide on body weight，TC，TG and the expression of hypothalam ic inflammatory pathway in obese rats.METHODS：Rats were given basal feed and high-fat diet；8 weeks later，they were divided into normal control group，obesity group and obesity-liraglutide group.Normal control group and obesity group were given 0.9%Sodium chloride injection intraperitoneally，and obesity-liraglutide group was given liraglutide 100μg/kg tw ice a day for consecutive 8 weeks.Rats were sacrificed after fasting overnight follow ing last adm inistration to weigh body weight.The levels of TC and TG in serum，the expression of NF-κB mRNA and SOCS-3 protein were detected beforemedication and after lastmedication.RESULTS：Compared w ith normal control group，body weight，the levels of TC and TG in serum，the expression of NF-κB mRNA and SOCS-3 protein were increased significantly in obesity group（P＜0.01）；compared w ith obesity group，above index of obesity-liraglutide group were decreased significantly（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Liraglutidemay significantly improve the increase of body weight and dyslipidem ia in high-fat diet induced obese rats，and themechanism m ight be associated w ith the improvement of hypothalamic inflammatory pathways.

Liraglutide；Obesity；Rats；Hypothalamus；NF-κB；SOCS-3

R965

A

1001-0408（2014）17-1571-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.17.11

2013-12-10

2014-02-13）

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