李曉雨 高穎娜 湯維芳 李 孟 鄭宏良

在機(jī)體中肌肉受到損傷或其他方式損害時(shí)，處于靜態(tài)狀態(tài)的成年骨骼肌干細(xì)胞被激活后增殖、遷移到指定的位點(diǎn)相互融合或受損的肌纖維形成新的肌纖維［1］。在體內(nèi)和體外，細(xì)胞外基質(zhì)在決策細(xì)胞命運(yùn)和行為中發(fā)揮了重要的作用［2］。細(xì)胞外基質(zhì)主要功能是支持各種細(xì)胞的生長和維持。同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)在骨骼肌肌纖維的力傳遞，維持和修復(fù)中起著重要的作用。在損傷和患病狀態(tài)，細(xì)胞外基質(zhì)顯著性的改變從而改變肌肉功能的屬性［3］。本研究組在體外分化培養(yǎng)小鼠骨骼肌成肌干細(xì)胞C2C12的基礎(chǔ)上，探討了3種常用細(xì)胞外生長基質(zhì)基質(zhì)膠、Ⅰ型膠原、多聚賴氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞分化形成肌管融合率的影響。

材料與方法

1．材料:細(xì)胞:C2C12細(xì)胞株(ATCC)試劑:高糖DMEM(Gibco公司)，F(xiàn)BS(Gibco公司)，Matrigel(BD Bioscience公司)，PLL、CollagenⅠ(Sigma 公司)，肌球蛋白(myosin)兔抗鼠抗體(Sigma公司)，Dylight488驢抗兔熒光二抗(Jackson公司)。

2．Matrigel、CollagenⅠ、PLL 的鋪制:按照表1中的溶液量分別加入24孔板，把鋪制的24孔板放入CO2孵箱中過夜，然后在無菌超凈臺(tái)中吸出多余的液體，然后在紫外燈下照射2h，隨后無菌狀態(tài)下自然風(fēng)干后，即可加入細(xì)胞培養(yǎng)。

表1 3種生長基質(zhì)的鋪制參數(shù)

3．細(xì)胞分化培養(yǎng):C2C12細(xì)胞復(fù)蘇后，用10%FBS的高糖DMEM增殖培養(yǎng)液傳3～4代，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，用0．05%胰酶-EDTA消化后制成密度為1．5×105/ml的細(xì)胞懸液，按1毫升/孔加入各已預(yù)鋪制的24孔板，CO2孵箱中過夜后，更換為2%HS的高糖DMEM分化培養(yǎng)基，隔天換液1次，第5日時(shí)可見大量及多核肌管形成。

4．細(xì)胞免疫熒光:常溫下用冷的4%多聚甲醛將分化培養(yǎng)5日的細(xì)胞固定10min后，用冷的0．01mol/L PBS洗滌3×5min后，在抗血清溶液(10%FBS，0．2%Triton-X-100 的0．01mol/L PBS)孵育30min后，用 PBST按1∶200稀釋的肌球蛋白一抗在室溫下孵育2h。隨后在PBST按1∶400稀釋的Dylight 488二抗4℃避光下過夜后，PBS洗滌洗滌3×5min后，用DAPI染核后，倒置顯微鏡20倍物鏡視野下每孔隨機(jī)選取5個(gè)畫面拍攝，每組3個(gè)復(fù)孔。然后計(jì)算肌管融合率。肌管融合率(%)=肌球蛋白陽性(myosin+)肌管細(xì)胞核數(shù)/同視野內(nèi)所有細(xì)胞核數(shù)×100%。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。P＜0．01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

3種生長基質(zhì)下C2C12細(xì)胞貼壁良好，分布均勻，細(xì)胞形態(tài)都比較圓滑飽滿，且方向一致性好。分化刺激培養(yǎng)過程可見部分細(xì)胞死亡，至第2日時(shí)，細(xì)胞開始變長，成為具有兩極的梭形狀，僅有少量細(xì)胞融合，分化培養(yǎng)至第5日時(shí)，可見大量長條形肌管形成，偶有少量分叉形肌管，如圖1所示，Matrigel培養(yǎng)融合的肌管比較粗大且方向一致性好，PLL培養(yǎng)融合的肌管較前兩組短且多核肌管數(shù)(≥3個(gè)核)相對(duì)較低。Matrigel、CollagenⅠ、PLL 3組的肌管融合率分別為21．9% ± 4．9%、8．0% ± 2．4%、14．4% ± 3．2%，且各組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。

圖1 3種生長基質(zhì)下Myosin陽性表達(dá)的C2C12細(xì)胞(標(biāo)尺100μm)

討 論

正常情況下，哺乳動(dòng)物的成年骨骼肌是穩(wěn)定的組織，幾乎沒有細(xì)胞核的更新。然而，一旦損傷，骨骼肌具有顯著的修復(fù)能力，啟動(dòng)快速和廣泛的修復(fù)過程以防止肌肉損失。其修復(fù)的初始階段包括肌衛(wèi)星細(xì)胞迅速激活、增殖、分化、融合，導(dǎo)致新的肌纖維形成和重塑的收縮功能。成年肌衛(wèi)星細(xì)胞是在這個(gè)過程中的一個(gè)關(guān)鍵要素［4］。骨骼肌纖維的修復(fù)和所涉及的不同的細(xì)胞反應(yīng)的激活是高度同步的過程。骨骼肌成肌干細(xì)胞的分化需要一系列信號(hào)的調(diào)控，細(xì)胞周圍基質(zhì)對(duì)成肌干細(xì)胞的融合有著強(qiáng)烈的影響。已有研究表明，與沒有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生長的細(xì)胞相比，在Ⅰ型膠原蛋白包被的表面上生長的小鼠骨骼肌干細(xì)胞C2C12分化融合更好［5］?；|(zhì)膠中生長的大鼠原代肌源性干細(xì)胞分化2天后，免疫熒光顯示其Pax7、MyoD、MyoG陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于生長于Ⅰ型膠原蛋白，且其細(xì)胞形態(tài)更長、更粗、分叉多，而膠原中細(xì)胞沒有分叉且相對(duì)比較圓滑［6］。同時(shí)，多聚賴氨酸也常常被用于成肌干細(xì)胞的研究之中［7～9］。

我們的實(shí)驗(yàn)觀察這3種最常用的生長基質(zhì)對(duì)C2C12細(xì)胞肌管形態(tài)及融合率的差別，其中基質(zhì)膠的肌管融合率最好且肌管相對(duì)粗大，Ⅰ型膠原培養(yǎng)組雖然肌管融合率最低，但是其肌管的長度及多核肌管數(shù)與基質(zhì)膠培養(yǎng)組相當(dāng)，都明顯高于多聚賴氨酸培養(yǎng)組。

基質(zhì)膠從EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基膜抽提物，主要包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、bFGF、EGF、IGF、TGFβ、PDGF、NGF［6，10］。在迄今為止確定的27個(gè)不同的膠原蛋白中，Ⅰ型膠原是纖維狀膠原含量最豐富的，也是是骨骼肌纖維周圍的間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，同時(shí)也是肌纖維再生后結(jié)締瘢痕組織的主要成分［11］。筆者的研究結(jié)果與Grefte等［6］研究表明在基質(zhì)膠和Ⅰ型膠原培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞增殖和分化的能力幾乎沒有差異的結(jié)果不一致，可能是由于Ⅰ型膠原的濃度或量差別，或者是由于C2C12細(xì)胞分化培養(yǎng)的時(shí)間不同所導(dǎo)致，但與其大鼠原代肌源性干細(xì)胞分化兩天后肌管生成情況相符。

基質(zhì)膠的主要成分包括高分子質(zhì)量的層粘連帶白 (800kDa)、Ⅳ型膠原(540kDa)和巢蛋白(158kDa)以及低分子質(zhì)量的各種蛋白生長因子(＜45kDa)［2］。L-多聚賴氨酸目前發(fā)現(xiàn)有3種分子質(zhì)量，即(70～150)kDa、(150～300)kDa及 ＞300kDa，分子質(zhì)量越大，黏附力越強(qiáng)［12］。我們采用的多聚賴氨酸分子質(zhì)量為(150～300)kDa，3種基質(zhì)的分子質(zhì)量差別也許是影響C2C12細(xì)胞肌管融合率的原因之一，此外已有研究指出生長基質(zhì)的彈性對(duì)肌源性干細(xì)胞的增殖和分化有所影響，但對(duì)其肌管生成卻無顯著影響［1］。雖然Ⅰ型膠原培養(yǎng)的C2C12的肌管融合率比其余兩組較低，但其肌管形態(tài)和基質(zhì)膠組都比多聚賴氨酸組相對(duì)粗大，而且多核細(xì)胞數(shù)(≥3個(gè)核)相對(duì)較多，更有利于C2C12分化融合實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究，這種結(jié)果也可能是因?yàn)榧?xì)胞種植在同一濃度1．5 ×105/ml，37℃ CO2孵箱過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞密度能達(dá)到80%以上，然后再刺激分化培養(yǎng)，整個(gè)過程忽略了生長基質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖的影響造成的。

鑒于C2C12細(xì)胞在3種生長基質(zhì)中的肌管生成情況，我們建議使用基質(zhì)膠作為優(yōu)化培養(yǎng)條件，能夠具有較高質(zhì)量的肌管和肌管生成率，為體外骨骼肌干細(xì)胞分化融合的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)條件。

1 Boonen KJ，Rosaria-Chak KY，Baaijens FP，et al．Essential environmental cues from the satellite cell niche:optimizing proliferation and differentiation［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2009，296(6):C1338-1345

2 Hughes CS，Postovit LM，Lajoie GA．Matrigel:a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture［J］．Proteomics，2010，10(9):1886-1890

3 Gillies AR，Lieber RL．Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix［J］．Muscle Nerve，2011，44(3):318-331

4 Charge SB，Rudnicki MA．Cellular and molecular regulation of muscle regeneration［J］．Physiol Rev，2004，84(1):209-238

5 Arnesen S，Mosler S，Larsen N，et al．The effects of collagen type I topography on myoblasts in vitro［J］．Connect Tissue Res，2004，45(4-5):238-247

6 Grefte S，Vullinghs S，Kuijpers-Jagtman AM，et al．Matrigel，but not collagen I，maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro［J］．Biomed Mater，2012，7(5):055004

7 Santos E，Orive G，Calvo A，et al．Optimization of 100 mum alginate-poly-L-lysine-alginate capsules for intravitreous administration［J］．J Control Release，2012，158(3):443-450

8 Almodovar J，Crouzier T，Selimovic S，et al．Gradients of physical and biochemical cues on polyelectrolyte multilayer films generated via microfluidics［J］．Lab Chip，2013，13(8):1562-1570

9 Ciofani G，Ricotti L，Danti S，et al．Investigation of interactions between poly-L-lysine-coated boron nitride nanotubes and C2C12 cells:up-take，cytocompatibility and differentiation［J］．Int J Nanomedicine，2010，5:285-298

10 Vukicevic S，Kleinman HK，Luyten FP，et al．Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components［J］．Exp Cell Res，1992，202(1):1-8

11 Goetsch KP，Kallmeyer K，Niesler CU．Decorin modulates collagen I-stimulated，but not fibronectin-stimulated，migration of C2C12 myoblasts［J］．Matrix Biol，2011，30(2):109-117

12 賀燕，彭康，周吉銀，等．L-多聚賴氨酸對(duì)原代海馬神經(jīng)元生長影響［J］．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(7):649-652