王大鵬 李 強(qiáng)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的重要輔酶，也是許多NAD消耗酶的底物。煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)是催化NAD生物合成的關(guān)鍵酶，它催化這一可逆反應(yīng)向前進(jìn)行，對(duì)維持體內(nèi)NAD水平的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在NMNAT催化下的NAD生物合成水平，不僅對(duì)于SIRT1的活性有重要影響，還能在沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)介導(dǎo)下改善生物體內(nèi)的葡萄糖代謝。人們還發(fā)現(xiàn)它對(duì)于代謝紊亂和衰老情況下胰島β細(xì)胞功能紊亂的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。NMNAT在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的三種亞型有著不同的亞細(xì)胞定位及組織分布，且功能各異。

1 NMNAT亞型及結(jié)構(gòu)

已有研究證明，哺乳動(dòng)物NMNAT存在三種亞型：NMNAT1-3，它們與嚙齒類動(dòng)物NMNAT的同源異構(gòu)體之間氨基酸序列的相似性很高。例如人NMNAT-1與小鼠NMNAT-1之間的氨基酸序列有80%左右的同一性；NMNAT-3之間比率相仿；而NMNAT-3同源異構(gòu)體之間的氨基酸序列同一性竟達(dá)99%(小鼠NMNAT多出4個(gè)氨基酸)。人NMNAT亞型之間結(jié)構(gòu)各異，亞細(xì)胞定位不同，且存在于各自的染色體，由各自的基因編碼。每一個(gè)種屬的哺乳動(dòng)物NMNAT都有其特異性且具有親和力的二價(jià)陽(yáng)離子。NMNATs也分別作用于不同底物：ITP、GTP、或其他嘌呤核苷酸底物的類似物。

有研究認(rèn)為其亞細(xì)胞定位是受功能特異性靶向作用區(qū)域(ISTIDs)調(diào)控，ISTIDs由單一外顯子編碼，這一控制區(qū)在低級(jí)別生命體中并不存在，而且其與NMNAT的酶促反應(yīng)無(wú)關(guān)。ISTIDs含有棕櫚?；?、磷酸化等翻譯后修飾位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAD池區(qū)域的劃分。

人NMNAT-1是一種同源六聚體結(jié)構(gòu)，其亞單位分子量為32 kD。在體內(nèi)含量最為豐富，表達(dá)也最為廣泛。編碼它的基因定位于染色體(1p32-35)，它含有279個(gè)氨基酸殘基，前四個(gè)氨基酸組成無(wú)序的羧基端。人NMNAT-1含有谷氨酸107—賴氨酸146的亞型高度特異性序列，由單一的亞型特異的外顯子編碼，該序列中包含了人NMNAT-1的細(xì)胞核定位信號(hào)以及調(diào)節(jié)人NMNAT-1—PARP-1反應(yīng)過(guò)程的磷酸化區(qū)域，所以人NMNAT-1僅定位于細(xì)胞核。

人NMNAT-2在中樞神經(jīng)組織中含量豐富，心臟和骨骼肌中也有表達(dá)，其基因定位于(1q25)，與NMNAT-1的基因序列同一性僅為34%～35%，但也含有四個(gè)氨基酸組成的無(wú)序羧基端。它共擁有307個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部含有由三個(gè)外顯子編碼的亞型特異性序列：賴氨酸107—亮氨酸192。其整體氨基酸序列根據(jù)功能結(jié)構(gòu)不同大致可分四個(gè)區(qū)域：喜入?yún)^(qū)：232個(gè)氨基酸殘基；準(zhǔn)入?yún)^(qū)：29個(gè)氨基酸殘基；易入?yún)^(qū)：1個(gè)氨基酸殘基；禁入?yún)^(qū)：2個(gè)氨基酸殘基。NMNAT-2是亞單位分子量為34千道爾頓的二聚體結(jié)構(gòu)。其性質(zhì)不穩(wěn)定，易于氧化，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)半衰期<2 h。因?yàn)槠浔砻嫘纬梢环N亞型特異性“外衣”，所以易被棕櫚酰化并貼附于高爾基復(fù)合體。

人NMNAT-3是一種同源四聚體結(jié)構(gòu)，分子量28 kD，含有252個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部亞型特異性序列為亮氨酸105—丙氨酸125，無(wú)序羧基端與前兩者相同，其N端的氨基酸序列決定了其線粒體定位。NMNAT-3的表達(dá)形式與NMNAT-2幾乎不重疊，含量明顯少于NMNAT-1。人體肺臟、脾臟、紅細(xì)胞中都有NMNAT-3的表達(dá)，在胎盤(pán)及腎臟中也有小范圍的組織分布〔1～4〕。

2 NMNAT的生物作用

2.1NMNAT的NAD合成活性 NAD是生物體內(nèi)重要的攜電子體和信號(hào)通路中的重要分子，它是生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的重要輔酶，這早已被人們所熟知。但其在生物體內(nèi)所發(fā)揮的作用還遠(yuǎn)不止這一種。人體內(nèi)許多NAD消耗酶都要以其為底物，例如：ADP核糖轉(zhuǎn)移酶、ADP核糖聚合酶、cADP核糖聚合酶以及去乙?；傅?。早已有研究證明，NAD除在氧化磷酸化和氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮其經(jīng)典作用外，還在基因轉(zhuǎn)錄、生命延長(zhǎng)及細(xì)胞死亡過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，更在糖代謝及生理節(jié)律的控制中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能〔5,6〕。NMNAT是體內(nèi)NAD生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)于維持體內(nèi)NAD水平至關(guān)重要。原核生物和一些低級(jí)別的真核生物體內(nèi)的NAD是由煙酸經(jīng)從頭合成途徑合成，而哺乳動(dòng)物體內(nèi)NAD主要經(jīng)補(bǔ)救合成途徑合成，而且其前體并不是煙酸，而是煙酰胺(NAM)。NAM在體內(nèi)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)的催化下生成煙酰胺單核苷酸(NMN)，后者經(jīng)NMNAT催化并在ATP的參與下生成NAD，同時(shí)幫助其維持穩(wěn)態(tài)。此反應(yīng)為可逆反應(yīng)且平衡常數(shù)接近于1，但現(xiàn)在認(rèn)為在體內(nèi)此反應(yīng)趨向于向前發(fā)生。生理情況下此可逆反應(yīng)會(huì)因缺乏焦磷酸(PPi)而受到抑制〔2〕。在催化過(guò)程中，三種不同的NMNAT亞型也具有不同的催化特性。在與NMN反應(yīng)之前，ATP要先與細(xì)胞核中的NMNAT-1或高爾基體中的NMNAT-2相綁定，但線粒體中NMNAT-3所催化的反應(yīng)順序卻正好相反，而且NMNAT-3利用ATP的效率更高。在反應(yīng)速度方面，NMNAT-1和NMNAT-3的催化速率相似，NMNAT-2相對(duì)較慢。

2.2NMNAT：一種新的分子伴侶 分子伴侶是一類有助于多種蛋白復(fù)合裝配、蛋白折疊以及蛋白損傷后再折疊的蛋白質(zhì)。NMNAT有獨(dú)立于其酶促反應(yīng)之外的分子伴侶功能。它可以在蛋白折疊過(guò)程中與APT相耦聯(lián)。如果去掉其羧基端，包括與ATP的綁定位置，則分子伴侶功能失效而NAD合成活性不變。通過(guò)對(duì)果蠅NMNAT(dNMNAT)的研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)它可以使非本體的蛋白質(zhì)構(gòu)造更加穩(wěn)固，還可以促使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降級(jí)或正確折疊。無(wú)論是野生型還是無(wú)活性的dNMNAT都可以在熱休克導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性中保護(hù)熒光素酶，從而在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)恢復(fù)過(guò)程中使熱變性的熒光素酶適當(dāng)?shù)脑僬郫B，發(fā)揮與熱休克蛋白70(HSP70)，HSP40以及HSP16.2相類似的作用。另外，重組dNMNAT可以在熱變性中保護(hù)檸檬酸合酶。NMNATs還可以減少蛋白聚合。在酵母菌蛋白研究模型中，NMNAT-1和NMNAT-2通過(guò)清理毒性蛋白減少了α突觸核蛋白—多聚谷氨酰胺介導(dǎo)的蛋白水解應(yīng)激〔7〕。NMNAT還是一種新型應(yīng)激反應(yīng)蛋白。dNMNAT的過(guò)表達(dá)能夠增加氧化應(yīng)激時(shí)果蠅的耐熱性，從而延長(zhǎng)果蠅壽命。在活體試驗(yàn)中，熱休克因子(HSF)與編碼NMNAT基因的啟動(dòng)子相綁定，誘導(dǎo)熱休克條件下NMNAT的表達(dá)。相反，在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)在HSF的介導(dǎo)下可直接上調(diào)NMNAT〔8〕。

2.3NMNATs的基因調(diào)控功能 近年來(lái)，NMNATs的基因調(diào)控功能也愈加被人們所重視?？茖W(xué)家Zhang等發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)NMNAT-1作為基因調(diào)節(jié)因子在PARP-1和SIRT1的介導(dǎo)下可以調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，例如ATXN10和NAT1，這些基因調(diào)控作用大多依賴NMNAT所催化的NAD合成；而也有一些基因的調(diào)控依賴于SIRT1的募集作用，SIRT1將NMNAT-1募集到目的基因的啟動(dòng)子，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過(guò)程〔7〕。

2.4年齡相關(guān)的滔蛋白病變與NMNAT 滔蛋白病變是一種與年齡密切相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以滔蛋白的異常磷酸化和過(guò)度聚合為特點(diǎn)。隨著年齡的增長(zhǎng)，滔蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)會(huì)引發(fā)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)空泡的形成和神經(jīng)纖維變性，導(dǎo)致年齡相關(guān)的自發(fā)性活動(dòng)的減少以及嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，甚至引發(fā)癡呆(阿爾茨海默病)。Yousuf等科學(xué)家曾以果蠅為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)NMNAT水平是學(xué)習(xí)和記憶功能障礙發(fā)生年齡的重要決定因素，中樞神經(jīng)系統(tǒng)NMNAT水平的降低會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙發(fā)病年齡的提前。在滔蛋白病變模型中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NMNAT的過(guò)表達(dá)可以明顯改善年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能缺陷。

3 NMNAT與糖代謝

3.1胰腺內(nèi)NMNAT的表達(dá) 2004年美國(guó)科學(xué)家Yalowitz等成功克隆出人NMNAT的cDNA，并利用其指導(dǎo)合成了人NMNAT-2，確認(rèn)人NMNAT的cDNA含有92個(gè)堿基對(duì)并指導(dǎo)合成了這個(gè)擁有307個(gè)氨基酸的多肽鏈，也提出盡管人NMNAT-2與人NMNAT-1僅有34%～35%的氨基酸序列同一性，但其酶活性卻與NMNAT-1相似。由于NAD的消耗會(huì)引起ATP池和GTP池當(dāng)中ATP和GTP含量下降，并由此導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損害引發(fā)胰島素依賴型糖尿病(IDDM)〔9〕，于是人工合成了人NMNAT-2唯一的表面抗原決定簇抗體，并在對(duì)正常成人胰腺取材進(jìn)行免疫組化分析后驚異的發(fā)現(xiàn)，胰腺外分泌細(xì)胞當(dāng)中NMNAT-2蛋白表達(dá)很少，而人胰島細(xì)胞上卻有明顯的NMNAT-2蛋白表達(dá)。雖然他們認(rèn)為NMNAT-2在胰島β細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)應(yīng)與其相似，但還不能將此表達(dá)直接定位于胰島β細(xì)胞，此后從胰島素瘤病人的胰腺組織中提取出可以分泌胰島素的腫瘤細(xì)胞，并確認(rèn)了其中NMNAT-2的高表達(dá)；而且因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞對(duì)于NAD的消耗非常敏感，NMNAT-2的高表達(dá)會(huì)增加胰島β細(xì)胞的生存概率。這些都佐證了NMNAT-2在人胰島β細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)與胰島其他細(xì)胞相一致〔10〕。

NAMPT為人們所熟知是以其另外一個(gè)身份：內(nèi)脂素(visfatin)，它是內(nèi)臟脂肪組織分泌的脂肪因子，是連接脂肪組織、炎癥和免疫的紐帶。其后人們又發(fā)現(xiàn)其蛋白結(jié)構(gòu)與前B細(xì)胞克隆因子蛋白結(jié)構(gòu)一致，而現(xiàn)在又已證實(shí)visfatin和NAMPT確為同一物質(zhì)。因此，NAMPT現(xiàn)也被稱為visfatin/PBEF/NAMPT〔11〕。NAMPT位于NAD生物合成途徑的上游，其作用是催化NAM生成NMN。Karen等用qRT-PCR方法評(píng)估了人胰島組織當(dāng)中NAMPT的基因水平，并用免疫熒光/共焦成像法測(cè)定了其在胰島組織中的表達(dá)，同時(shí)也闡述了葡萄糖對(duì)于人胰島β細(xì)胞當(dāng)中NAMPT的表達(dá)、分泌和調(diào)節(jié)的影響。這也從某種程度上與NMNAT在胰島β細(xì)胞當(dāng)中的表達(dá)相契合〔12〕。

3.2NMNAT與SIRT1 SIRT1是去乙酰化酶(Sirtuins)家族當(dāng)中七個(gè)成員(SIRT1-7)之一，是NAD依賴的脫乙酰酶類，其對(duì)于糖脂代謝的重要作用廣為人知〔13～15〕：它不僅能夠促進(jìn)哺乳動(dòng)物的脂肪代謝和脂肪酸氧化，而且其活性的改變還參與了衰老和肝臟脂肪變性等病理生理過(guò)程。最近有研究表明，SIRT1不僅可以抵抗氧化應(yīng)激和炎癥給胰島β細(xì)胞帶來(lái)的損害，其對(duì)于代謝紊亂和衰老情況下胰島β細(xì)胞功能紊亂的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。為了證明定位于細(xì)胞核內(nèi)的人NMNAT-1是NMNAT家族中負(fù)責(zé)調(diào)解SIRT1的關(guān)鍵酶，科學(xué)家Zhang等以 WldS 小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)部NAD對(duì)SIRT1有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞Sir2和SIRT1的功能依賴于其脫乙酰酶活性，而這一活性需要NMNAT所催化的NAD輔助。NAM既是NAD補(bǔ)救合成途徑中NAD的前體，也是利用Sirtuins 和PARP-1且依賴NAD的蛋白修飾作用的副產(chǎn)物，它可以抑制Sir2和SIRT1 的活性。與此同時(shí)，在研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)SIRT1的控制作用時(shí)，人們已著眼于NAMPT和NMNAT-1這兩種NAD補(bǔ)救合成途徑當(dāng)中的重要合成酶，他們利用NAM的消除和NAD的生成調(diào)節(jié)SIRT1活性〔16〕。一項(xiàng)在乳腺癌細(xì)胞上分別進(jìn)行的NAMPT和NMNAT-1基因敲除實(shí)驗(yàn)顯示，敲除后細(xì)胞內(nèi)下降的NAD水平改變了基因表達(dá)的總體模式，而且SIRT1會(huì)與那些通常受NAMPT和NMNAT-1調(diào)節(jié)的基因啟動(dòng)子相綁定，SIRT1和SIRT1組蛋白脫乙酰酶的活性也在這些啟動(dòng)子上受到NAMPT和NMNAT-1調(diào)節(jié)〔17,18〕。

3.3SIRT1對(duì)胰島素分泌的影響 一項(xiàng)基于胰島β細(xì)胞特異性SIRT1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠(BESTO小鼠)的研究顯示：SIRT1對(duì)于胰島β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)有陽(yáng)性調(diào)節(jié)作用，增加胰島β細(xì)胞中SIRT1的含量可以明顯增強(qiáng)GSIS，并可改善BESTO轉(zhuǎn)基因小鼠的糖耐量。甚至在長(zhǎng)達(dá)30 w的高脂飲食誘發(fā)的糖尿病條件下，仍可以增強(qiáng)GSIS。相反，SIRT1缺乏的小鼠模型則表現(xiàn)出GSIS功能下降，這進(jìn)一步說(shuō)明了SIRT1對(duì)于胰島β細(xì)胞GSIS功能調(diào)節(jié)的重要性〔19〕。Kathryn Moynihan Ramsey等在衰老的雄性BESTO小鼠模型上發(fā)現(xiàn)，西式的高脂飲食導(dǎo)致的體重增加和單一血脂增高都不足以消除SIRT1給胰島β細(xì)胞帶來(lái)的益處〔20〕。針對(duì)SIRT1調(diào)節(jié)胰島素分泌的機(jī)制，Bordone等科學(xué)家進(jìn)行了深入的研究，他們發(fā)現(xiàn)UCP2可以引發(fā)葡萄糖刺激的胰島素分泌缺陷。UCP2的上調(diào)與細(xì)胞在受到葡萄糖刺激后無(wú)法增加ATP水平有關(guān)。而UCP2基因的敲除則可以使SIRT1水平較低的胰島β細(xì)胞恢復(fù)分泌胰島素的能力。最后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：SIRT1正是通過(guò)與UCP2啟動(dòng)子直接綁定來(lái)抑制UCP2，增加胰島素分泌，這一過(guò)程調(diào)節(jié)了葡萄糖生成ATP的解耦聯(lián)，而增高的ATP水平觸發(fā)了胰島β細(xì)胞膜去極化及鈣離子依賴的泡吐作用〔21,22〕。另有研究顯示：SIRT1可以分別通過(guò)FOXO1和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-Κb)的p65亞單元的去乙?；瘜?duì)代謝應(yīng)激和細(xì)胞因子介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞死亡起保護(hù)作用〔19〕。最近也有學(xué)者認(rèn)為，受NMNAT調(diào)節(jié)的NAD合成以及其依賴于SIRT1的促胰島素分泌機(jī)制有可能也參與了胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的促胰島素分泌過(guò)程。

3.4SIRT1對(duì)胰島素敏感性的影響 已有確鑿的證據(jù)證明在限制能量攝入(CR)的條件下，SIRT1介導(dǎo)的STAT3的去乙酰化作用不僅可以增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，還能增強(qiáng)胰島素刺激的PI3-K信號(hào)。肝臟SIRT1的缺乏會(huì)損傷PPARα的功能，降低脂肪酸的β氧化，在高脂飲食條件下引發(fā)肝臟脂肪變性、炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔23〕。在正常膳食情況下，肝臟SIRT1的缺乏會(huì)損傷哺乳動(dòng)物mTORC2/AKT信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)，引發(fā)慢性高血糖癥、氧化應(yīng)激以及全身性胰島素抵抗〔24〕。在脂肪組織中，脂肪組織特異的SIRT1缺如會(huì)導(dǎo)致肥胖加重，使衰老和高脂飲食引發(fā)的糖尿病模型加重胰島素抵抗〔25〕。最近有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以促進(jìn)PPARγ對(duì)Prdm16的募集作用和PPARγ去乙?；餐閷?dǎo)的白色脂肪組織的“棕色脂肪化”，進(jìn)而改善胰島素敏感性〔26〕。

NMN是NMNAT介導(dǎo)的NAD生物合成途徑的中間產(chǎn)物，也是NAD的前體。Yoshino等科學(xué)家通過(guò)以糖尿病小鼠肝臟組織為模型的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了NMN可以增加胰島素信號(hào)通路中AKT的磷酸化水平，進(jìn)而改善胰島素敏感性〔27〕，還可以通過(guò)下調(diào)諸多胰島素抵抗相關(guān)基因的表達(dá)，如NF-ΚB、Lipin1、Pbk4等，從而改善胰島素抵抗。在這一調(diào)節(jié)過(guò)程中，SIRT1正是重要的中間環(huán)節(jié)之一〔28,29〕。

綜上所述，NMNATs作為生物體內(nèi)重要的管家酶，其在氧化還原反應(yīng)當(dāng)中的重要地位毋庸置疑。依賴于NMNAT所維持的生物體內(nèi)NAD水平，SIRT1的活性對(duì)胰島素分泌，胰島素抵抗等諸多方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，更有學(xué)者提出了“NAD WORLD”的概念〔30〕，其中包含了NAD依賴的SIRT1活性的改變、NAMPT-NMNAT所調(diào)節(jié)的NAD及其中間產(chǎn)物(NMN)的生物合成，它們共同組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，涵蓋了代謝與衰老的生理病理過(guò)程，調(diào)節(jié)方式，影響因素，治療靶點(diǎn)等多個(gè)領(lǐng)域。相信其無(wú)論在基礎(chǔ)研究還是在臨床預(yù)防治療方面都有無(wú)限的發(fā)展前景。

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