曹 清 朱清仙

(九江市第三人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

乙型肝炎病毒(HBV)是最常見的雙鏈DNA病毒，其中HBV復(fù)制中間體為共價閉合環(huán)狀DNA(ccc DNA)，為mRNA和前基因組RNA合成提供模板，是HBV復(fù)制的重要標(biāo)志之一〔1〕。HBV感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎(CHB)診斷及療效判斷常用指標(biāo)包括HBV熒光定量PCR、血清免疫標(biāo)志物及肝功能等。目前基礎(chǔ)研究證實(shí)，抑制或清除HBV ccc DNA是治療CHB重要方法之一〔2〕。本研究旨在分析CHB患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBV DNA、ccc DNA及肝組織免疫組化的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2011年1月至2013年1月于我院治療的CHB患者60例，根據(jù)有無接受正規(guī)抗病毒治療分為未治療組(n=42)和治療組(n=28)。入選標(biāo)準(zhǔn)〔3〕：排除其他類型病毒性肝炎(甲、丙、丁、戊)重疊感染，排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和藥物性肝炎等其他肝病。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝癌、黃疸較深、明顯腹水、明顯出血傾向、多臟器功能衰竭及其他不適合肝穿活檢者。所有患者簽署知情同意書。未治療組男26例，女22例，年齡21～53〔平均(33.3±5.5)〕歲，HBeAg陰性11例，陽性31例；治療組男12例，女16例，年齡24～56〔平均(35.1±7.2)〕歲，HBcAg陰性7例，陽性21例。治療組經(jīng)聚乙二醇化干擾素α-2a抗病毒治療48 w。自未治療組中選取28例患者為對照組，男13例，女15例，年齡24～51〔平均(35.9±8.2)歲〕，HBeAg陰性6例，陽性22例，對照組和治療組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組分別進(jìn)行血清和肝組織ccc DNA檢測及肝組織免疫組化檢測。

1.2方法

1.2.1病毒學(xué)檢測 血清HBV DNA檢測采用熒光定量PCR技術(shù)，試劑盒由廣州中山達(dá)安基因有限公司提供，陰性參考值為<1×103拷貝/ml。

1.2.2HBV標(biāo)志物檢測 血清HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供。

1.2.3肝功能檢測 血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALT、總膽紅素(TBiL)、白蛋白(ALB)用全自動生化分析儀OLYMPUS AU 400檢測，試劑由北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.4肝臟活體組織穿刺病理檢查〔4〕在彩超引導(dǎo)下進(jìn)行肝穿刺活檢，組織長度約1.0～1.5 cm，后用10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，切片(厚度4 μm)。采用蘇木素-伊紅(HE)常規(guī)染色，冰凍切片膠原纖維(MASSON)三色染色及網(wǎng)狀纖維染色，采用CMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系列讀片。同時進(jìn)行Knodell HAI和纖維化評分。對肝組織進(jìn)行免疫組化標(biāo)記，試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.5肝組織cccDNA實(shí)時熒光定量PCR的特異性檢測 使用眼科剪將離心管中的肝組織剪碎，并加入10倍體積的抽提緩沖液并振搖使其完全分散于溶液中。將裂解細(xì)胞的懸液置于50℃水浴中3 h。等體積經(jīng)0.5 mol/L Tris.cl(pH 8.0)平衡的酚加入溶液中并緩慢地來回顛倒離心管10 min。形成乳濁液后于室溫以5 000 r/min離心15 min，使兩相分開。用大口徑移液管(出口徑為0.3 cm)將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中，用酚重復(fù)抽提2次。酚抽提取第三次將全部水相移至另一離心管中，于室溫加0.2體積的10 mmol/L乙酸銨和2倍體積的乙醇，充分混合，即形成DNA。測定DNA樣品在260 nm和280 nm處的光吸收。將DNA貯存于4℃冰箱。熒光檢測儀自動讀取并記錄CT值，計(jì)算出拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1未治療組患者血清學(xué)資料 未治療組中HBeAg陽性與陰性患者之間ALT水平〔(149.43±56.38)vs(135.45±67.47)U/L〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HBeAg陽性患者血清HBV DNA水平〔(6.84±1.24)log10IU/ml〕和肝細(xì)胞HBV ccc DNA水平〔(5.71±1.22)log10IU/ml〕均較HBeAg陰性患者〔(5.12±1.27)、(4.37±1.14)log10IU/ml〕顯著升高(P<0.05)。

2.2未治療組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與肝纖維化分期的相關(guān)性分析 未治療組患者肝細(xì)胞中HBV DNA(r=-0.215，P=0.034)和ccc DNA水平均與肝組織纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，其中ccc DNA呈強(qiáng)相關(guān)性(r=-0.523，P=0.004)，與ALT水平則無相關(guān)性(r=0.024，P=0.796)。肝細(xì)胞HBV DNA和ccc DNA之間未顯示相關(guān)性(r=0.064，P=0.642)。與ALT水平則無相關(guān)性(r=0.037，P=0.784)。

2.3肝細(xì)胞內(nèi)HBV ccc DNA與血清HBV DNA水平的相關(guān)性分析 對所有80例患者進(jìn)行分析，結(jié)果提示肝細(xì)胞內(nèi)HBV ccc DNA水平〔(5.7 ± 1.5)log10IU/ml〕與血清HBV DNA〔(6.1 ± 1.3)log10IU/ml〕無相關(guān)性(r=0.079，P=0.525)。

2.4抗病毒治療患者體內(nèi)HBV標(biāo)志物的表達(dá)水平 治療48 w后肝細(xì)胞HBV DNA、 ccc DNA〔(2.85±1.12)、(3.17±1.12)log10IU/ml〕較對照組〔(5.45±1.43)、(5.86±1.53)log10IU/ml〕顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問題之一，全球約20億人曾感染過HBV，慢性HBV感染者約有3.5億人成為，我國慢性無癥狀HBV攜帶者約1.2億〔5〕。新發(fā)的或時間相對較短的CHB患者檢測HBeAg陽性，被稱為HBeAg陽性的CHB。但隨著感染時間的延長，部分患者出現(xiàn)了HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致了HBeAg陽性的CHB患者比率逐漸下降，而HBeAg陰性的CHB患者比率逐漸升高〔6〕。在HBeAg陰性期，HBeAg檢測陰性、ALT持久正常(PNAL)、血清HBV DNA水平很低或不可測、肝活檢顯示肝臟炎性壞死程度極微或無炎性壞死和肝纖維化程度極輕微到輕微，絕大多數(shù)患者處于非活動性、病毒低復(fù)制狀態(tài)(非活動性HBV攜帶狀態(tài))，但部分HBeAg陰性患者會發(fā)展為免疫激活狀態(tài)(即HBeAg陰性CHB)，主要表現(xiàn)為ALT升高及高血清HBV DNA水平〔7〕。肝細(xì)胞核內(nèi)有穩(wěn)定的ccc DNA存在，是慢性感染的基礎(chǔ)之一，核苷類抗病毒藥不能清除ccc DNA以致停藥后復(fù)發(fā)。因此只有徹底清除細(xì)胞內(nèi)ccc DNA才能根治HBV感染。診斷肝臟纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)是肝組織的病理切片檢查，但操作存在風(fēng)險性，因此高特異性及敏感性的血清學(xué)指標(biāo)是肝纖維化診斷學(xué)研究的熱點(diǎn)方向。有報道稱，CHB患者血清內(nèi)檢測到高含量HBV ccc DNA，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與肝組織損傷嚴(yán)重程度(肝臟病理評分的高低)有關(guān)〔8〕。肝細(xì)胞內(nèi)以及血清HBV ccc DNA與肝臟組織纖維化程度之間的關(guān)系，可通過更大樣本量試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究顯示血清中ccc DNA水平與ALT值密切相關(guān)，從而說明患者血清中ccc DNA水平是肝臟損害的標(biāo)志，可作為反映肝功能的又一臨床參數(shù)。另外，肝組織纖維程度與肝細(xì)胞HBV ccc DNA呈負(fù)相關(guān)，HBV DNA水平與肝內(nèi)病毒復(fù)制情況不存在相關(guān)性。

4 參考文獻(xiàn)

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