趙光堅(jiān)

（廣東省廣州市天河區(qū)婦幼保健院，廣東 廣州 510627）

孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測(cè)在唐氏綜合征產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

趙光堅(jiān)

（廣東省廣州市天河區(qū)婦幼保健院，廣東 廣州 510627）

目的探討檢測(cè)孕婦血漿中胎兒游離DNA在診斷唐氏綜合征中所發(fā)揮的作用。方法隨機(jī)選取2011年2月至2012年2月在我院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的孕婦40例，其中包括正常產(chǎn)檢、高齡或唐氏綜合征需實(shí)施羊水穿刺的高危孕婦等，分為正常男胎妊娠組15例，正常女胎妊娠組13例，唐氏綜合征男胎妊娠組12例。通過實(shí)時(shí)定量的PCR技術(shù)，對(duì)孕婦血漿中胎兒游離DNA水平變化進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)。結(jié)果正常男胎妊娠組及唐氏綜合征男胎妊娠組均檢測(cè)出DYS14基因及β-actin基因，正常女胎妊娠組因無Y染色體，未檢出DYS14基因。正常男胎妊娠組的DYS14基因定量數(shù)值為（31.9±17.6）GE/mL，范圍分布為23～66 GE/mL，而唐氏綜合征男胎妊娠組的DYS14基因定量數(shù)值為（74.6±31.2）GE/mL，范圍分布為56～108 GE/mL。結(jié)論采用實(shí)時(shí)定量的PCR技術(shù)，對(duì)孕婦血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，是一種較為操作快捷、經(jīng)濟(jì)合理的非創(chuàng)傷性產(chǎn)前篩查。

唐氏綜合征；胎兒；游離DNA；產(chǎn)前檢查；PCR

唐氏綜合征，又名21三體綜合征或先天愚型，是一種最為常見的先天性染色體非整倍體遺傳疾病，多發(fā)于高齡產(chǎn)婦，發(fā)病率約在1/600～1/800，此類新生兒往往面容特殊，存在較為嚴(yán)重的智力障礙，并伴有先天性心臟病等各類畸形病癥，并增大了患有白血病的概率，由于尚無切實(shí)有效的治療方法[1]，容易給家庭帶來較大的經(jīng)濟(jì)壓力以及精神痛苦，也容易給社會(huì)帶來沉重的負(fù)面效應(yīng)，因此較為切實(shí)可行的有效措施是出生干預(yù)。本文通過使用實(shí)時(shí)定量的PCR技術(shù)，對(duì)孕婦血漿中胎兒游離DNA水平進(jìn)行測(cè)定，探討一種方便快捷、經(jīng)濟(jì)合理的非創(chuàng)傷性產(chǎn)前篩查方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2011年2月至2012年2月在我院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的孕婦40例，其中包括正常產(chǎn)檢、高齡或唐氏綜合征需實(shí)施羊水穿刺的高危孕婦等，分為正常男胎妊娠組15例，正常女胎妊娠組13例，唐氏綜合征男胎妊娠組12例。三組孕婦平均年齡均為（30±4）歲，平均孕周為（19±3）周，均未有妊娠合并癥且均為初產(chǎn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 制備樣本

抽取5 mL孕婦外周血，置入含有乙二胺四乙酸抗凝劑的無菌管內(nèi)，離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為2000轉(zhuǎn)/分，將上層血漿吸取置入無菌Eppendorf離心管內(nèi)，離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為13000轉(zhuǎn)/分，再將上層血漿吸取分裝，置入-80 ℃的冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取胎兒游離DNA

取出待檢的血漿400 μL，采用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取，并使用緩沖劑50 μL洗脫每份DNA標(biāo)本。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（Taqman探針法）

分別對(duì)DYS14基因以及β-actin基因進(jìn)行擴(kuò)增，操作方法為：DYS14基因：溫度94 ℃，共計(jì)用時(shí)5 min，循環(huán)數(shù)為40次，其中94 ℃變性15 s，退火/延伸溫度55 ℃ 15 s，60 ℃ 50 s；β-actin基因：溫度94℃，共計(jì)用時(shí)5 min，循環(huán)次數(shù)為 40次，其中94 ℃變性15 s，退火/延伸溫度60 ℃，時(shí)間60 s。每完成1個(gè)循環(huán)，自動(dòng)進(jìn)行1次熒光值檢測(cè)。

各反應(yīng)管中熒光信號(hào)抵達(dá)預(yù)先設(shè)定好的熒光閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)即為CT值，每一模板的CT值同此模板的起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，通過起始拷貝數(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣本測(cè)定出的CT值確定出樣本的DNA含量，然后以每個(gè)細(xì)胞中6.6 pg DNA為基準(zhǔn)，將每毫升血漿中含有的DNA拷貝數(shù)換算出來，單位為GE/mL[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 9.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

3組孕婦均檢出β-actin基因。15例正常男胎妊娠組和12例唐氏綜合征男胎妊娠組均檢出DYS14基因，特異性和敏感性均達(dá)到100%。正常女胎妊娠組由于不存在Y染色體，未能檢出 DYS14基因。其中正常男胎妊娠組的DYS14基因定量數(shù)值為（31.9±17.6）GE/mL，范圍分布為23～66 GE/mL，而唐氏綜合征男胎妊娠組的DYS14基因定量數(shù)值為（74.6±31.2）GE/mL，范圍分布為56～108 GE/mL（P＜0.01）。

3 討 論

3.1 游離DNA的發(fā)現(xiàn)及來源

幾十年前，已有研究人員發(fā)現(xiàn)人體的外周血中存在著微量游離核酸，不久之后，通過腫瘤患者的外周血檢測(cè)出具備腫瘤特征的游離DNA，并證明大多數(shù)游離DNA來自腫瘤細(xì)胞[3]。而在妊娠這一過程中，胎盤滋養(yǎng)層浸潤(rùn)子宮壁與腫瘤細(xì)胞侵入的機(jī)制極為相似，差異在于胎盤滋養(yǎng)層的浸潤(rùn)具備空間及時(shí)間特性。從免疫學(xué)的角度來看，胚胎和母體的關(guān)系，也與腫瘤和機(jī)體的關(guān)系相類似，在這一發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)下，研究人員推測(cè)，在孕婦的外周血腫應(yīng)同樣存在著胎兒的游離DNA，在隨后的研究中，成功地采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，從孕婦血漿中的游離DNA中擴(kuò)增獲得男性胎兒的SRY基因序列，證明胎兒的DNA能夠以游離DNA的狀態(tài)進(jìn)入孕婦的外周血循環(huán)中，并穩(wěn)定存在[4]。

在進(jìn)一步的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，胎兒游離DNA的來源以及釋放機(jī)制大致包括下列3種：①進(jìn)入孕婦外周血的胎兒有核細(xì)胞凋亡，釋放游離DNA。這部分細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等，進(jìn)入情況包括滋養(yǎng)層基膜及絨毛毛細(xì)血管的內(nèi)皮組織等幾種類型，在這一過程中，胎兒的有核細(xì)胞可能出現(xiàn)凋亡。然而經(jīng)過進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血中含有的胎兒有核細(xì)胞數(shù)量較少，而血漿中的游離DNA含量卻較為豐富，尤其是早產(chǎn)孕婦的血漿中，胎兒的有核細(xì)胞數(shù)量未見增加，游離DNA的含量卻有顯著的增高，分娩2 h后，胎兒游離DNA便全部消失，胎兒有核細(xì)胞卻能夠在母體血漿中存活27年，因此孕婦血漿中源自胎兒有核細(xì)胞的胎兒游離DNA比例較?。虎谕ㄟ^母胎界面進(jìn)入孕婦外周血。經(jīng)檢測(cè)羊水中胎兒游離DNA的濃度較孕婦血漿中的濃度高近200倍，但臍血漿中母源性DNA的含量在胎兒血循環(huán)中總游離DNA的比例平均僅為0.9%，而孕婦血漿中的胎兒游離DNA含量占母體血循環(huán)中總游離DNA的比例平均為14.3%，因此即便胎兒游離DNA能夠穿過胎盤，也不可能是孕婦血漿中胎兒游離DNA的主要來源；③胎盤滋養(yǎng)層的細(xì)胞凋亡，釋放胎兒游離DNA。胎盤滋養(yǎng)層是一種胎源組織，承擔(dān)著母體和胎兒間物質(zhì)交換的作用，當(dāng)孕期為4周時(shí)，母體血液將滋養(yǎng)層的間隙完全充滿，令滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠侵入子宮基層，故而合體滋養(yǎng)層細(xì)胞便有可能深入母體血液之中，在整個(gè)妊娠期間，胎盤細(xì)胞均在不斷凋亡，而超過50%的凋亡細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞，這是由于胎盤在妊娠早期時(shí)所處的環(huán)境始終相對(duì)缺氧，因此造成大量的滋養(yǎng)層細(xì)胞因缺氧而凋亡，釋放出的膜包裹凋亡小體中含有大量DNA。由此可見，孕婦血漿中胎兒游離DNA的主要來源，便是凋亡的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。

3.2 胎兒游離DNA的制備分析

本次研究通過兩步離心法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，分第一次離心將血漿及紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等成分沉淀分離開來，第二次利用超高速離心的方法，將血漿中滯留的少量細(xì)胞成分完全分開，獲得純凈的血漿樣本，確保了在產(chǎn)前篩查以及診斷過程中樣本的可靠性，同時(shí)證實(shí)，利用孕婦血漿中的胎兒游離DNA進(jìn)行產(chǎn)前篩查以及診斷，比使用胎兒細(xì)胞更加具有優(yōu)勢(shì)。

使用Taqman探針法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)每一次的PCR循環(huán)，對(duì)樣本起始模板中拷貝數(shù)量的測(cè)定更加準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，避免了以終產(chǎn)物做定量測(cè)定而造成的偏差。同時(shí)，由于Taqman探針的靈敏性和特異性極高，假陽(yáng)性的發(fā)生率較低，因此使測(cè)定工作更加準(zhǔn)確、高速。此外，通過本次研究發(fā)現(xiàn)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作便捷、使用安全、污染度低、高自動(dòng)化、高通量、高效率，能夠在2～3 h內(nèi)完成近百個(gè)樣本的定量分析工作，適合大規(guī)模的產(chǎn)前篩查及病情診斷工作。

在本次對(duì)于唐氏綜合征男胎妊娠的臨床診斷工作中，采用孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測(cè)的方法，檢測(cè)結(jié)果為（74.6±31.2）GE/mL，與正常男胎妊娠組的（31.9±17.6）GE/mL相比，高出2～3倍，由此可以證實(shí)，唐氏綜合征男胎妊娠組孕婦血漿中的胎兒游離DNA的含量會(huì)出現(xiàn)明顯的增加，結(jié)合孕婦外周血中胎兒游離DNA來源的研究可以得出結(jié)論，檢測(cè)胎兒游離DNA能夠作為篩查和診斷唐氏綜合征的候選指標(biāo)。

綜上所述，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)孕婦血漿中胎兒游離DNA的檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、便捷、安全、高效、高通量等諸多優(yōu)勢(shì)，值得在臨床診斷及檢測(cè)工作中大力推廣。

[1] 宋桂紅,田立霞.胎兒有核紅細(xì)胞在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].國(guó)際生殖健康計(jì)劃生育雜志,2008,27(4):237-239.

[2] 李子軍.胎兒有核紅細(xì)胞與無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2008,35(6):398-401.

[3] 李敏清.絨毛活檢在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(6):978-980.

[4] Engel K,Plonka T,Bilar M,et al.The correlation between clinical characteristics of pre-eclampsia and the concentration of fetal DNA in maternal circulation[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2008,139(2):256-257.

Detection of Pregnant Women Cell-free Fetal DNA in Plasma in the Application of the Prenatal Diagnosis of Down's Syndrome

ZHAO Guang-jian
(Guangzhou Tianhe District MCH Hospital, Guangzhou 510627, China)

ObjectiveTo evaluate the detect pregnant women cell-free fetal DNA in plasma of the role in the diagnosis of down syndrome.MethodsRandomly selected from February 2011 to February 2011 in our hospital antenatal examination of pregnant women 40 cases, including normal prenatal, old age or down syndrome need to implement an amnio high-risk pregnant women, divided into normal male pregnancy group and control group, 15 cases of normal female pregnancy group of 13 cases, 12 cases of down syndrome male pregnancy group. Through real time quantitative PCR technology for pregnant women to detect cell-free fetal DNA in plasma level changes.ResultsNormal male pregnancies and down's syndrome male pregnancy group were detected DYS14 gene and beta actin, normal female pregnancy because there was no Y chromosome, DYS14 gene was not detected. Normal male pregnancy group DYS14 gene quantitative values for GE/mL (31.9±17.6), the scope of distribution of 23-66 GE/mL, and down syndrome pregnancy group male DYS14 gene quantitative values for GE/mL (74.6±31.2), the scope of distribution for 56-108 GE/mL.ConclusionUsing real-time quantitative PCR technique, cellfree fetal DNA in plasma were detected for the pregnant woman, is a more efficient, economic and reasonable operation of non invasive prenatal screening.

Down's syndrome; Fetuses; Cell-free DNA; Antenatal examination; PCR

R714.53

B

1671-8194（2014）16-0011-02