李 浩，張?zhí)K麗，楊 艷，曾曉榮△，劉慧榮△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系，2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069；3.瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理研究室，四川瀘州646000）

機(jī)體微血管對(duì)組織器官的血流供應(yīng)以及血壓的維持具有至關(guān)重要的作用［1］，微血管功能結(jié)構(gòu)障礙也是高血壓、冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病變基礎(chǔ)。因此，對(duì)微血管的檢測(cè)是心腦血管疾病研究的一個(gè)重要方面。1972年Bevon［2］首次提出在離體條件下測(cè)量微血管張力的辦法，此技術(shù)1976后被 Mulvaney和 Harper［3，4］等人進(jìn)一步發(fā)展。目前，微血管環(huán)技術(shù)已覆蓋腸系膜微動(dòng)脈［5］、肺微動(dòng)脈［6］、腎動(dòng)脈血管［7］、大腦中動(dòng)脈［8］等全身多臟器微血管。目前，關(guān)于微血管環(huán)技術(shù)在心腦血管疾病研究中應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)在逐年增多，但是由于微血管環(huán)技術(shù)操作步驟復(fù)雜精細(xì)，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于該技術(shù)的傳播，且在國(guó)內(nèi)對(duì)此技術(shù)在的應(yīng)用并不普及［9］，很多學(xué)者對(duì)其操作過(guò)程不甚清楚，難以做出具有良好收縮、舒張活性的微血管環(huán)，而筆者發(fā)現(xiàn)對(duì)血管進(jìn)行分離固定之后，在進(jìn)行血管功能檢測(cè)前，需對(duì)血管進(jìn)行有效的刺激才可使血管活性充分激發(fā)。通過(guò)對(duì)微血管前負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)化及高鉀的刺激，可使血管具有良好的收縮舒張功能，提高了實(shí)驗(yàn)的成功率及穩(wěn)定性，從而節(jié)省了時(shí)間和成本。本文擬以腸系膜三級(jí)動(dòng)脈分支為例，介紹微血管環(huán)技術(shù)的具體操作及注意事項(xiàng)，在加入血管活性藥物檢驗(yàn)血管功能前給予血管充分的刺激以激活血管，讓更多的學(xué)者了解和學(xué)習(xí)，并利用該技術(shù)開(kāi)展研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

HEPES液（mmol／L，NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES 5，葡萄糖 11.0；pH 7.4）、高鉀液（mmol／L，NaCl 29.8，KCl 120，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES5，葡萄糖 11.0；pH 7.4）、重酒石酸去甲腎上腺素（norepinephrine，NE，禾豐，上海）、硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP，雙鶴，北京）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh，Sigma，美國(guó)）。

1.2 儀器

Multi Myograph System-610M張力測(cè)定儀（Danish Myo Technology A／S公司，丹麥）、PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)、鋼絲-40μm（ADInstruments，澳大利亞）、雙目解剖顯微鏡、顯微手術(shù)器械 、不銹鋼金屬絲剪刀（World Precision Instruments，美國(guó)）、有蓋培養(yǎng)皿（注1／2硅酮樹(shù)脂）、傳感器定標(biāo)工具箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄不限。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 DMT（danish myo technology）定標(biāo) 本操作的目的是對(duì)張力測(cè)定儀張力測(cè)定的校準(zhǔn)，步驟如下：（1）張力測(cè)定儀中的肌動(dòng)描計(jì)器含有一對(duì)獨(dú)特的不銹鋼鉗夾，其中1個(gè)鉗夾連接到一個(gè)螺旋測(cè)微器，用于調(diào)節(jié)脈管的周長(zhǎng)。另一個(gè)鉗夾連接到1個(gè)內(nèi)置的高靈敏度張力傳感器，用于測(cè)量脈管張力。在連接高靈敏度張力傳感器的鉗夾上固定一根鋼絲，預(yù)熱DMT裝置，直到灌流液溫度達(dá)到設(shè)定溫度（37℃）。灌流液的高度至少蓋住鉗夾，嚴(yán)禁不加灌流液進(jìn)行干加熱。對(duì)DMT示數(shù)調(diào)零。（2）先把定標(biāo)套件放到肌動(dòng)描計(jì)器上方，定標(biāo)套件的杠桿下的針?lè)旁阡摻z與連接高靈敏度張力傳感器的鉗夾之間，不能碰到任何一方，開(kāi)始DMT定標(biāo)。先不加砝碼，根據(jù)DMT屏幕上的提示加2 g砝碼，2 g的砝碼放在背離操作屏的一面，使鋼絲受到向外的張力。定標(biāo)前后各記錄一段時(shí)間然后進(jìn)行單位轉(zhuǎn)換，無(wú)砝碼時(shí)為0 mN，加入2 g砝碼后為9.81 mN。

1.4.2 血管的游離 參考文獻(xiàn)［10］的方法，將大鼠腸系膜浸入含有4℃已經(jīng)通過(guò)氧氣的HEPES液的平皿，平皿下方放置一冰袋，平皿內(nèi)用大頭針固定動(dòng)脈主干和腸管。從一級(jí)或二級(jí)動(dòng)脈開(kāi)始用顯微鑷夾取脂肪，然后用顯微剪沿血管走行方向?qū)⒅痉蛛x干凈，將脂肪剔除后首先區(qū)分動(dòng)靜脈，靜脈的分支比較圓頓成“U”型，而動(dòng)脈分支較尖銳成“V”型，區(qū)別開(kāi)后可將靜脈減掉。血管分離干凈后，選擇帶有二級(jí)和三級(jí)的血管分支，保留另一小段其它分支，以便血管的夾取，剪取血管環(huán)。

1.4.3 血管的固定 首先在肌動(dòng)描記器內(nèi)注入適量HEPES液體，用不銹鋼金屬絲剪刀剪取直徑40 μm的鋼絲，移動(dòng)肌動(dòng)掃描器內(nèi)一側(cè)的鉗夾將鋼絲夾住，一端用螺絲固定，另一端用于血管的穿入，注意用顯微鑷夾血管時(shí)不要夾需要測(cè)量的那段血管，防止血管彈性損壞，張力數(shù)據(jù)不準(zhǔn)。盡量夾在穿血管時(shí)要剪掉的那段血管或是其他分支，血管穿入過(guò)程中要輕柔緩慢不要過(guò)度牽拉，盡量從血管中心穿入鋼絲以防損傷內(nèi)皮。穿入后固定鋼絲另一端，將多余的血管減掉，留置2 mm的三級(jí)分支。然后將第二個(gè)鋼絲緩慢插入血管，插入血管后鋼絲兩端固定。

1.4.4 血管的標(biāo)準(zhǔn)化 設(shè)置DMT標(biāo)準(zhǔn)化模塊各項(xiàng)參數(shù)，打開(kāi) LabChart軟件，選擇 DMT-＞Normallization Settings，參數(shù)設(shè)置如下：Eyepiece calibration（mm／div）：0.36，Target pressure（kPa）：13.3（血管在正常生理狀態(tài)處于100 mmHg［3］左右的壓強(qiáng)下，這一參數(shù)可以根據(jù)研究組織的不同更改），IC1／IC100：0.9［10］，Online averaging time（seconds）：0，delay time（s）：120。再次打開(kāi) DMT菜單，選擇 DMT-＞通道 1（2，3，4），顯示a1、a2，其代表微血管在目鏡下的起始刻度，填上之后會(huì)自動(dòng)計(jì)算血管的長(zhǎng)度；Wire diameter即金屬絲的直徑，一般選擇40μm，也有25μm金屬絲可選。將兩根鋼絲調(diào)整為平行零距離，固定血管漕漕溫度恒定在37℃，平衡期每隔15 min用預(yù)熱的HEPES液（37℃）更換浴漕內(nèi)液體一次。血管環(huán)的張力變化通過(guò)DMT的換能系統(tǒng)采集，并用LabChart軟件記錄在電腦上。溫育60 min后，每隔2 min通過(guò)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)Myograph的螺旋測(cè)微尺逐步牽拉血管環(huán)，輸入螺旋測(cè)微計(jì)讀數(shù)并點(diǎn)擊Add Point后，左下方會(huì)顯示出螺旋測(cè)微計(jì)對(duì)應(yīng)對(duì)數(shù)時(shí)組織的收縮張力Force及有效壓強(qiáng)ERTP。當(dāng)加入的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的ERTP大于設(shè)定的目標(biāo)壓強(qiáng) 13.3 kPa（100 mmHg）時(shí)，就不需要再加入點(diǎn)了。此時(shí)軟件會(huì)自動(dòng)算出要使血管處于標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)周長(zhǎng)時(shí)，螺旋測(cè)微計(jì)的讀數(shù)，即MicrometerX1。把螺旋測(cè)微計(jì)調(diào)到對(duì)應(yīng)的讀數(shù)MicrometerX1，就完成了組織張力的初始化。

1.4.5 血管的激活 （1）使用歸零鍵使基線歸零。在開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)之前，用60 mmol／L的高鉀溶液預(yù)收縮，連續(xù)兩次，當(dāng)相鄰兩次刺激的收縮幅度差別不大于10%，認(rèn)為血管環(huán)組織結(jié)構(gòu)完整，功能正常。（2）更換HEPES液，血管回到基線后平衡30 min以上。

1.4.6 血管舒張功能的檢測(cè) （1）內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的檢測(cè)：向浴槽內(nèi)加入終濃度為10-5mol／L的NE，待血管達(dá)到最大收縮值并穩(wěn)定后，累計(jì)加入終濃度為10-9～10-5mol／L的ACh，注意加下一個(gè)舒張藥的時(shí)機(jī)為上一次舒張變緩直至穩(wěn)定之后。實(shí)驗(yàn)完畢后用正常HEPES液連續(xù)沖洗三遍，待血管張力恢復(fù)至基礎(chǔ)狀態(tài)并穩(wěn)定30 min后，再開(kāi)始下一輪實(shí)驗(yàn)。（2）非內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的檢測(cè)：向浴槽內(nèi)加入終濃度為10-5mol／L的NE，待血管達(dá)到最大收縮值并穩(wěn)定后，累計(jì)加入終濃度為10-9～10-5mol／L的SNP，方法同上。

2 結(jié)果

2.1 血管標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果

如圖1，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程，可得到LabChart軟件記錄的微血管張力變化曲線，可見(jiàn)拉伸血管之后，血管張力急劇升高后稍微回落至張力穩(wěn)定，即為處于此刻血管周長(zhǎng)時(shí)的血管張力。通過(guò)LabChart軟件中的DMT標(biāo)準(zhǔn)化模塊，可自動(dòng)計(jì)算出不同血管周長(zhǎng)的收縮張力Force及有效壓強(qiáng)ERTP，描繪出制橫坐標(biāo)為血管環(huán)內(nèi)周長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為單位長(zhǎng)度血管環(huán)張力的指數(shù)曲線圖（圖2A），其中橫坐標(biāo)為血管內(nèi)周長(zhǎng)ICi＝205.6＋2Xi，縱坐標(biāo)為單位長(zhǎng)度血管環(huán)張力 Ti＝Fi／2L，圖中直線圖為 Pi＝2兀 Ti／ICi，其中 Pi（kPa）為設(shè)定的有效壓強(qiáng) 13.3 kPa（100 mmHg），Ti（mN／mm）：?jiǎn)挝婚L(zhǎng)度血管環(huán)張力，ICi（μm）：血管環(huán)內(nèi)周長(zhǎng)，F(xiàn)i（mN）：血管環(huán)總張力，可由 Myograph顯示器得出，Xi（μm）：兩根鋼絲間的距離，可由 MyograPh螺旋測(cè)微尺讀出，L（mm）：血管環(huán)長(zhǎng)度，可用解剖纖維鏡上的目鏡測(cè)微尺測(cè)出。圖2中曲線與直線的交點(diǎn)代表此時(shí)血管有效跨壁壓為13.3 kPa，從而得出有效跨壁壓為13.3 kPa時(shí)的血管環(huán)內(nèi)周長(zhǎng)IC100，及可使血管張力變化最敏感的血管環(huán)內(nèi)周長(zhǎng)IC1（IC1／IC100：0.9［10］），當(dāng)加入的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的 ERTP大于設(shè)定的目標(biāo)壓強(qiáng) 13.3 kPa（100 mmHg）時(shí)，就不需要再加入點(diǎn)了。此時(shí)軟件會(huì)自動(dòng)算出要使組織處于標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)周長(zhǎng)（IC1）時(shí)，螺旋測(cè)微計(jì)的讀數(shù)，即 MicrometerX1（圖2B）。

2.2 微血管對(duì)收縮藥和舒張藥物的反應(yīng)曲線

加入10-5mol／L NE后，血管收縮，張力曲線升高，直至達(dá)到平臺(tái)維持平衡，張力由3 mN升至19 mN，之后依次加入 10-9～10-5mol／L的 ACh或 SNP，血管張力成梯度降低，ACh和SNP引起的最大舒張率分別為80%和95%（圖3）。

Fig.1 Response curve of microvascular tone in the process of microvascular normalization

Fig.2 Relationship between microvascular resting wall tension and internal circumference

Fig.3 Response curve of microvascular tone after given the vasoactive drugs

3 討論

在正常生理?xiàng)l件下，血管內(nèi)是充滿血液的，因此血管壁處于一定的張力狀態(tài)下。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血管內(nèi)沒(méi)有血液的壓力，因此血管處于相對(duì)放松狀態(tài)，這與正常的生理情況不相符。為了最大限度接近正常狀態(tài)，需要給血管一定的初始張力以模擬血壓。以往文章有給予微血管固定張力或給予血管固定周長(zhǎng)，但由于微血管比較小，粗細(xì)變化比較大，不能像大血管環(huán)［11］一樣給予固定前負(fù)荷，否則導(dǎo)致給予血管的有效壓強(qiáng)參差不齊而不具有代表性，將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差，而本文通過(guò)DMT標(biāo)準(zhǔn)化模塊可得出血管在一定壓強(qiáng)下的最佳前負(fù)荷，通過(guò)微血管張力的標(biāo)準(zhǔn)化，獲得離體組織最佳的實(shí)驗(yàn)條件，使血管跨壁壓接近于正常生理狀態(tài)，更好的模仿生理狀態(tài)下血管功能變化，且使組織的張力變化對(duì)血管活性藥物更加敏感，從而更好地觀察。激活血管時(shí)，在高鉀環(huán)境中，血管平滑肌去極化，導(dǎo)致血管收縮，是一種不涉及受體引起血管收縮的離子通道機(jī)制，因此能反映并激活血管最基本的收縮活性。本研究通過(guò)血管標(biāo)準(zhǔn)化確定微血管的最佳前負(fù)荷以及血管標(biāo)準(zhǔn)化和高鉀環(huán)境對(duì)血管的不斷刺激，可使血管活性充分激發(fā)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在加入血管活性藥物后血管可出現(xiàn)明顯的穩(wěn)定的收縮舒張反應(yīng)，具有較好的穩(wěn)定性。微血管環(huán)技術(shù)不僅可用于各種模型血管功能的檢測(cè)，同時(shí)在藥理學(xué)等多方面展開(kāi)用途。本文從基本的微血管張力功能檢測(cè)入手展示微血管環(huán)的技術(shù)應(yīng)用，技術(shù)困難之處在于血管的分離與固定，其操作精細(xì)，且需在解剖顯微鏡下操作，因此需要較長(zhǎng)時(shí)間的練習(xí)才能做出活性較好的血管。另外如若不對(duì)微血管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或操作不清楚，隨意給予微血管初始張力，導(dǎo)致給予血管的有效壓強(qiáng)參差不齊而不具有代表性，將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差，而通過(guò)幾次的練習(xí)，便可將微血管的標(biāo)準(zhǔn)化初步掌握。血管的收縮藥和舒張藥本實(shí)驗(yàn)以NE、ACh、SNP為代表，在操作中也可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更改，也可觀察不同藥物對(duì)血管的收縮或舒張反應(yīng)。

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