謝 靜，崔 屹，耿 彬，唐朝樞，曾 強(qiáng)△

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學(xué)中心，北京100853；2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京100191）

腎上腺髓質(zhì)素 2（adrenomedullin 2，ADM2）是一種具有心血管保護(hù)作用的小分子活性肽，歸屬于降鈣素基因相關(guān)肽超家族。已知該家族成員中腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM）是心腎系統(tǒng)重要的保護(hù)因子，降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)舒血管物質(zhì)，而ADM2能夠發(fā)揮類似甚至更強(qiáng)于ADM和CGRP的生物學(xué)作用［1］。盡管諸多研究表明ADM2可以擴(kuò)張外周血管阻力、降低血壓［2，3］，但其對動脈血壓影響的具體機(jī)制目前仍不清楚。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）過度激活是高血壓形成的重要機(jī)制之一，效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可誘發(fā)血管內(nèi)皮發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂、血管舒張障礙［4］。本實驗擬通過研究ADM2對AngⅡ的拮抗作用，探討ADM2可能的降壓機(jī)制和病理生理意義。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。1002型微量滲透泵購自美國Alzet公司。EA.hy 926購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。ADM2購自美國Phoenix Pharmaceutical INC，AngⅡ購自美國 Sigma公司。一氧化氮 （nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶 （nitric oxide synthase，NOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司?；罴?xì)胞活性氧檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組與給藥方法

18只6周齡雄性 SD大鼠，180～200 g，18只，隨機(jī)分為 3組（n＝6）：對照組、AngⅡ組和 AngⅡ ＋ADM2組。將AngⅡ和ADM2溶于100μl生理鹽水后注入微量滲透泵，用1%戊巴比妥鈉（3μl／g）腹腔注射將大鼠麻醉后，于其頸后部正中位置做一長約1 cm的縱行切口，將泵置入皮下，泵開口背對切口，持續(xù)皮下給藥，AngⅡ劑量為 150 ng／（kg·min），ADM2劑量為 500 ng／（kg·h），對照組以等量生理鹽水注入微量滲透泵，同法埋于皮下，各組給藥時間為14 d［5］。

1.3 大鼠動脈血壓和心率的測定

應(yīng)用BL-420E生物機(jī)能試驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）測定大鼠動脈血壓。用1%戊巴比妥鈉（3μl／g）腹腔注射將大鼠麻醉后，固定、剪毛。于頸前部正中做1 cm的縱行切口，分離出左側(cè)頸總動脈，將動脈導(dǎo)管向心臟方向插入1.5 cm（導(dǎo)管至換能器圓帽內(nèi)充滿0.3%肝素），結(jié)扎并固定導(dǎo)管，記錄大鼠動脈血壓和心率的變化。

1.4 大鼠心重／體重指數(shù)的計算

實驗開始前，給大鼠稱重并記錄。大鼠脫臼處死后，開胸取出心臟，在 Krebs液（118 mmol／L NaCl、4.7 mmol／L KCl、1.18 mmol／L KH2PO4、1.17 mmol／L MgSO4、25 mmol／L NaHCO3、2.5 mmol／L CaCl2、11 mmol／L Glucose，pH 7.4）中輕輕擠壓心臟，漂洗凈心腔內(nèi)血液，用濾紙吸干水分后稱重并記錄。按公式計算：心重／體重指數(shù) ＝心臟重量（mg）／體重（g）。

1.5 血漿中NO和eNOS的測定

經(jīng)動脈導(dǎo)管的三通管取血，滴入含有肝素的離心管中，4℃，3 500 r／min，離心 10 min，取上層血漿分裝，-80℃凍存待用。NO含量測定用硝酸還原酶法，eNOS活性測定用化學(xué)比色法。實驗操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 大鼠動脈活性氧的檢測

大鼠處死后，迅速分離胸主動脈、腹主動脈和腸系膜上動脈，置于4℃Krebs液中，小心修剪動脈周圍脂肪和結(jié)締組織后，切成長約1 cm的動脈條，用濾紙吸干表面水分后包埋于OCT中。用冰凍切片機(jī)將動脈按6μm厚度切片，1μmol／L DHE常溫避光孵育30 min后，于倒置熒光顯微鏡下觀察ROS熒光強(qiáng)度并拍照，進(jìn)行定量分析。

1.7 離體血管環(huán)的制備及張力測定

另取6只正常SD大鼠脫臼處死后，迅速分離胸主動脈、腸系膜上動脈、尾動脈，置于4℃預(yù)冷的Krebs液中，去除管周脂肪和結(jié)締組織。胸主動脈和腸系膜上動脈剪成兩段長約4 mm的血管環(huán)，尾動脈制成兩個長約1.5 mm的血管條，各血管環(huán)分別取出一段用與血管內(nèi)徑相適的表面粗糙的細(xì)銅絲穿過并捻動以去除內(nèi)皮。動脈環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，水平懸掛在10 ml浴槽內(nèi)，下方固定，上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器（JS-101型），經(jīng)計算機(jī)生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。浴槽內(nèi)通以95%O2＋5%CO2混合氣體飽和處理的37℃的Krebs液10 ml。主動脈、腸系膜上動脈、尾動脈血管環(huán)懸掛于浴槽后，將基礎(chǔ)張力分別調(diào)至2 g、1.5 g、0.7 g，平衡 1 h，每 20 min換一次營養(yǎng)液。在使用一段血管環(huán)時，其余血管環(huán)保留在95%O2＋5%CO2混合氣體飽和處理的37℃恒溫灌流槽中以保持其活力。所有動脈環(huán)用100 mmol／L KCl反復(fù)多次刺激，當(dāng)連續(xù)2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別＜5%時表明標(biāo)本對刺激穩(wěn)定，可開始正式實驗。加入乙酰膽堿（10-5mol／L）使血管環(huán)舒張，觀察其舒張幅度，小于 KCl收縮幅度的10%時，認(rèn)為內(nèi)皮去除完全；大于KCl收縮幅度的80%表明內(nèi)皮完整。觀察并記錄AngⅡ（10-6mol／L）誘發(fā)血管環(huán)收縮后加入不同濃度 ADM2（10-9～10-7mol／L）對動脈環(huán)收縮曲線的影響。動脈環(huán)張力曲線經(jīng)chart軟件處理，計算升高幅度（升高幅度%＝（最高值-基礎(chǔ)值）／基礎(chǔ)值×100%）。

1.8 活細(xì)胞活性氧的檢測

取生長狀態(tài)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy 926細(xì)胞接種于預(yù)先放有無菌玻片的24孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)50%時，將細(xì)胞孔分4組，分別給予500 nmol／L AngⅡ和 0 nmol／L、50 nmol／L、100 nmol／L、500 nmol／L ADM2。聯(lián)合孵育4 h后，培養(yǎng)基中加入終濃度為10μmol／L熒光探針 DCFH-DA，避光孵育30 min。倒掉培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌培養(yǎng)孔3次，取出玻片，滴加20μl抗熒光淬滅封片劑，置于載物片上，于倒置熒光顯微鏡下觀察ROS熒光強(qiáng)度并拍照，進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ADM2對大鼠血壓、心率和心重／體重指數(shù)的影響

與正常對照組相比，AngⅡ組大鼠收縮壓和舒張壓均顯著升高，心重／體重指數(shù)亦升高（P＜0.05，P＜0.01，表1）。而與 AngⅡ組相比，AngⅡ ＋ADM2組大鼠的收縮壓、舒張壓和心重／體重指數(shù)均有顯著改善（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.2 ADM2對大鼠血漿中NO含量和eNOS活性的影響

檢測大鼠血漿發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，AngⅡ組NO含量顯著減少，eNOS活性降低（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。而 AngⅡ ＋ADM2組 NO含量和 eNOS活性均恢復(fù)至正常水平（P＜0.01，表2）。

2.3 ADM2對大鼠動脈管壁超氧化物生成量的影響

AngⅡ和ADM2干預(yù)14 d后，取大鼠胸主動脈、腹主動脈和腸系膜上動脈，檢測管壁原位超氧化物水平，正常對照組平均熒光強(qiáng)度分別為1.04±0.05、1.13±0.17和 1.05±0.09；AngⅡ組平均熒光強(qiáng)度分別為3.17±0.42、2.74±0.41和4.01±0.40，明顯高于正常對照組（P＜0.01）；AngⅡ ＋ADM2組平均熒光強(qiáng)度較AngⅡ組明顯減弱，分別為1.11±0.31、0.99±0.20和 0.95±0.15（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of ADM2 on blood pressure，heart rate and HW／BWof AngⅡ-induced hypertension rat（ˉx±s，n＝6）

Tab.2 Plasma NO contents and eNOSactivity in rat（ˉx±s，n＝6）

2.4 不同濃度ADM2對大鼠血管環(huán)緊張度（%）的影響

分別取大鼠主動脈、腸系膜上動脈和尾動脈制成血管環(huán)，用 AngⅡ（10-6mol／L）預(yù)收縮血管，可見在內(nèi)皮完整的情況下，10-9mol／L、10-8mol／L、10-7mol／L ADM2使主動脈血管環(huán)緊張度從（24.96±1.62）%分別下降至（15.33±3.02）%、（13.00±4.65）%、（5.04±3.87）%；使腸系膜上動脈血管環(huán)緊張度從（19.95±1.60）%分別降至（10.20±1.96）%、（6.75±1.82）%、（2.95±0.94）%；使尾動脈血管環(huán)緊張度從（30.70±2.88）%分別降至（16.65±3.27）%、（10.25±2.85）%、（2.85±2.01）% （P＜0.05，表3）。去除內(nèi)皮后，雖ADM2仍可使血管環(huán)呈濃度依賴性舒張，但舒張程度較內(nèi)皮完整組顯著下降。主動脈血管環(huán)緊張度從（39.94±0.85）%分別下降至（35.26±0.81）%、（34.19±1.31）%、（27.13±2.82）%；腸系膜上動脈血管環(huán)緊張度從（29.38±1.23）%分別降至 （24.81±0.88）%、（21.69±1.53）%、（18.69±1.25）%；尾動脈血管環(huán)緊張度從（40.31±1.45）%分別降至（39.20±0.10）%、（37.56±0.24）%、（37.25±0.29）%（P＜0.05，表 3）。

2.5 ADM2對內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響

選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy 926檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。以500 nmol／L AngⅡ作對照，用不同濃度的 ADM2（50、100和 500 nmol／L）與AngⅡ聯(lián)合孵育細(xì)胞4 h，鏡下可見隨著ADM2濃度的升高，綠色熒光數(shù)量逐漸減少、亮度逐漸減弱（圖1A），細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生明顯減少，平均熒光強(qiáng)度分別為 7.18±0.87、4.21±0.30、1.93±0.36、1.16±0.15（P＜0.05，圖 1B）。500 nmol／L ADM2幾乎完全拮抗了500 nmol／L AngⅡ引發(fā)的活性氧的產(chǎn)生。

Tab.3 Effect of different concentrations of ADM2 on the change of tension（%）in rat arteries preconstricted by AngⅡ（ˉx±s，n＝6）

Fig.1 Inhibitory effect of ADM2 on AngⅡ（500 nmol／L）-induced intracellucular ROSgeneration produced within EA.hy 926（n＝3，×100）

3 討論

血管細(xì)胞旁／自分泌的小分子活性物質(zhì)調(diào)節(jié)紊亂是高血壓發(fā)病的新機(jī)制。自發(fā)現(xiàn)ADM2十年來，已被證實其在心臟和血管均有表達(dá)［6，7］，是心血管系統(tǒng)的保護(hù)因子［8］。本研究通過給大鼠皮下埋植微量滲透泵的方法，恒速持續(xù)外源性給予AngⅡ和ADM2，觀察AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，ADM2對血壓的影響。給藥AngⅡ14 d后，大鼠收縮壓和舒張壓均有較溫和的升高，心重／體重指數(shù)增加，這表明AngⅡ成功誘導(dǎo)了大鼠高血壓的形成并伴有大鼠心臟的肥厚，符合壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)適應(yīng)性改變的特點(diǎn)。聯(lián)合給予ADM2組大鼠血壓雖沒有完全恢復(fù)至正常對照組水平，但與單純給予AngⅡ組大鼠相比，其血壓有所回落且組間差異明顯，提示ADM2可以部分拮抗AngⅡ的作用，降低AngⅡ升高的血壓。

覆蓋在血管內(nèi)膜面的內(nèi)皮細(xì)胞能生成、激活和釋放多種生物活性因子調(diào)節(jié)血管功能。收縮因子與舒張因子之間平衡失調(diào)會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為血管舒張功能降低。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞在eNOS催化作用下不斷合成并釋放NO到血漿和血管平滑肌中，激活血管平滑肌內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP濃度升高，游離鈣的濃度降低，維持外周阻力血管正常舒張狀態(tài)，穩(wěn)定血壓。而AngⅡ可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使eNOS活性降低，NO生成減少且消耗增加，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張能力減弱，血壓升高。研究發(fā)現(xiàn)ADM2可顯著提高eNOS活性，增加血漿NO含量，提示血漿中NO含量的增加可能介導(dǎo)了ADM2的降血壓作用，而ADM2可能通過提高eNOS活性改善血管內(nèi)皮功能。這與楊等［9］對孵育的血管組織的研究結(jié)論是一致的。觀察不同濃度ADM2對大鼠離體血管環(huán)緊張度的影響，進(jìn)一步證實ADM2呈濃度依賴性舒張血管環(huán)并具有內(nèi)皮依賴性，去除內(nèi)皮后，ADM2舒血管作用顯著降低。這表明血管內(nèi)皮細(xì)胞是ADM2的重要作用靶點(diǎn)，ADM2通過改善內(nèi)皮對NO的合成和釋放發(fā)揮舒張血管的功能。另外，在大鼠血管壁冰凍切片和培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞熒光染色實驗中，結(jié)果均表明ADM2能夠拮抗AngⅡ引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有強(qiáng)大的抗氧化能力。因此，我們推斷ADM2可能通過拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激效應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮舒張血管、降低血壓的作用。

［1］ Wimalawansa SJ.Amylin，calcitonin gene-related peptide，calcitonin，and adrenomedullin：a peptide superfamily［J］.Crit Rev Neurobiol，1997，11（2-3）：167-239.

［2］ Taylor MM， Bagley SL， Samson WK.Intermedin／adrenomedullin-2 acts within central nervous system to elevate blood pressure and inhibit food and water intake［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，288（4）：R919-927.

［3］ Yuan Y，Wang X，Zeng Q，et al.Effects of continuous intermedin infusion on blood pressure and hemodynamic function in spontaneously hypertensive rats［J］.J Geriatr Cardiol，2012，9（1）：17-27.

［4］ Turoni CJ，Maranon RO，Proto V，et al.Nitric oxide modulates reactivity to angiotensin II in internal mammary arterial grafts in hypertensive patients without associated risk factors［J］.Clin Exp Hypertens，2011，33（1）：27-33.

［5］ 陳紫薇，李冬冬，史向黨，等.一種體內(nèi)恒速持續(xù)給藥的方法：微量滲透泵［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，1997，13（3）：278-280.

［6］ Roh J，Chang CL，Bhalla A，et al.Intermedin is a calcitonin／calcitonin gene-related peptide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor／receptor activitymodifying protein receptor complexes［J］.J Biol Chem，2004，279（8）：7264-7274.

［7］ Takei Y，Inoue K，Ogoshi M，et al.Identification of novel adrenomedullin in mammals：a potent cardiovascular and renal regulator［J］.FEBSLett，2004，556（1-3）：53-58.

［8］ Bell D，McDermott BJ.Intermedin（adrenomedullin-2）：a novel counter-regulatory peptide in the cardiovascular and renal systems［J］.Br J Pharmacol，2008，153（Suppl 1）：S247-262.

［9］ 楊靖輝，賈月霞，任永生，等.中葉素1-53對大鼠動脈血壓的影響及其作用機(jī)制 ［J］.中華高血壓雜志，2005，13（11）：711-715.