蘭忠平，陳雅慧，顧 楠，熊利澤，孫焱芫△

（1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，陜西 延安716000；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉科，陜西西安710032）

阿片類藥物是目前臨床治療中、重度疼痛最有效的藥物，但隨著使用嗎啡劑量增大和時(shí)間的增加，易產(chǎn)生耐受和依賴等不良反應(yīng)，現(xiàn)在臨床采用一些輔助藥來加強(qiáng)和延長(zhǎng)阿片或其他鎮(zhèn)痛劑的作用，減少不良反應(yīng)的發(fā)生率。胍丁胺有望成為有效的嗎啡鎮(zhèn)痛輔助藥物。我們采用椎管內(nèi)給藥（胍丁胺和嗎啡）方法，可以減少嗎啡用量，加強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛，減輕嗎啡耐受和依賴。本研究目的擬用在體實(shí)驗(yàn)，探討胍丁胺作為椎管內(nèi)阿片類藥物輔助藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和藥品

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重（200±20）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為6組（n＝10）。C1、C2組組：鞘內(nèi)注射生理鹽水 10μl；M1、M2組：鞘內(nèi)注射嗎啡（15μg／10μl）；AM1、AM2組：鞘內(nèi)同時(shí)給予嗎啡 15μg＋胍丁胺 12.5 μg／10μl。其中3組所有大鼠均于鞘內(nèi)給藥后5 min于跖部皮下注射蜜蜂毒50μl（0.2 mg）致痛，觀察并紀(jì)錄 1 h內(nèi)大鼠的自發(fā)縮足反射次數(shù)。另外3組大鼠用來測(cè)定機(jī)械痛閾和熱刺激閾值。鹽酸嗎啡（批號(hào)：910907），青海制藥廠；胍丁胺（57H1361），2，5－二甲基惡唑，1，4－雙［2’（5－苯基惡唑）－2］－苯，三羥甲基氨基甲烷（Tris，批號(hào)：940920）；蜜蜂毒（Bee venom；BV）（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）。

1.2 鞘內(nèi)置管術(shù)

按Yaksh等［1］首先報(bào)道的方法進(jìn)行改良。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40～50）mg／kg麻醉消毒后，從背側(cè)頸7水平沿中線向尾側(cè)做切口，暴露并去除胸4局部椎板（約1 mm×1 mm），剪開硬脊膜，經(jīng)鞘內(nèi)向尾側(cè)置入聚乙烯PE10導(dǎo)管（購(gòu)自日本Natume公司），根據(jù)動(dòng)物大小確定置入導(dǎo)管至腰膨大處的距離3～5 cm，實(shí)驗(yàn)后解剖動(dòng)物確定鞘內(nèi)導(dǎo)管的位置?？p合傷口，局部使用慶大霉素抗感染。術(shù)后3～4 d，觀察動(dòng)物狀態(tài)良好，無活動(dòng)障礙，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 自發(fā)痛反應(yīng)測(cè)量

將一透明有機(jī)玻璃箱（30 cm×30 cm×30 cm）放置在高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)30 cm的架子上，以便于實(shí)驗(yàn)者觀察動(dòng)物后足的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)30 min以上，使之逐漸安靜，實(shí)驗(yàn)者一人固定大鼠，另一人將微量注射器連接鞘內(nèi)管外口，以0.5μl／s的速度推注嗎啡或胍丁胺，然后用 10μl生理鹽水沖洗導(dǎo)管，封閉管口防止液體外漏，5 min后重新固定大鼠，盡快將BV注入大鼠一側(cè)后肢足底中心皮下，放回實(shí)驗(yàn)箱，開始計(jì)時(shí)，觀察并紀(jì)錄1 h內(nèi)大鼠的自發(fā)縮足反射次數(shù)。

1.4 機(jī)械痛閾的測(cè)定

將一透明有機(jī)玻璃箱（30 cm×30 cm×30 cm）放置在頂部為鐵絲網(wǎng)的30 cm高的架子上便于觀察，將待測(cè)大鼠置于箱中，待大鼠適應(yīng)安靜后，實(shí)驗(yàn)者手持Von－Frey纖維（North Coast Medical，Inc，加拿大）穿過鐵絲網(wǎng)格垂直刺激大鼠后肢足底正中足掌部，使之稍成S形，持續(xù)4～6 s。大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開Von Frey纖維時(shí)立即出現(xiàn)快速的抬足反應(yīng)，記為陽(yáng)性反應(yīng)，而身體活動(dòng)所引起的抬足反應(yīng)則不納入陽(yáng)性范疇。每隔10 s測(cè)1次，連續(xù)10次，誘發(fā)≥5次抬足的Von Frey纖維對(duì)應(yīng)的壓力值作為50%的機(jī)械抬足閾值，即機(jī)械痛閾。最大折力為20 g，大于此值時(shí)記為20 g。

1.5 熱刺激潛伏期的測(cè)量

大鼠分別置于5 mm厚玻璃板的透明有機(jī)玻璃箱中（30 cm×30 cm×30 cm）放置在高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)30 cm的架子上便于觀察。待大鼠適應(yīng)環(huán)境并安靜后，用輻射燈源垂直對(duì)準(zhǔn)大鼠一側(cè)后肢跖部中后1／3處照射，且落在足底的照射光圈直徑為5 mm。記錄從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射時(shí)間（s），此即為熱刺激反應(yīng)潛伏期。重復(fù)測(cè)量3次，同一部位間隔10 min，不同部位間隔5 min，取平均值作為熱刺激反應(yīng)潛伏期并作為定量指標(biāo)，如＞30 s無反應(yīng)則停止照射，以免導(dǎo)致足底組織過度熱損傷，熱刺激反應(yīng)潛伏期計(jì)為30 s。熱痛閾計(jì)算：每只大鼠在用藥前1天先測(cè)定熱痛閾潛伏期作為基礎(chǔ)熱痛閾值，大鼠用藥前后各測(cè)定熱刺激潛伏期3次，取均值，即為用藥前后熱痛閾值。測(cè)量結(jié)果用最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分率（percentage of maximal possible effect，MPE%）表示，最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)改變百分比（MPE%）＝給藥后痛閾（s）-給藥前痛閾（s）／光照截止時(shí)間（30 s）-給藥前痛閾（s）

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)注差表示，組內(nèi)比較采用 t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。應(yīng)用方差分析（ANOVA Fisher’S PLSD）做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 胍丁胺聯(lián)合嗎啡對(duì)大鼠蜜蜂毒模型自發(fā)縮足反射的影響

足底注射蜜蜂毒可誘致大鼠產(chǎn)生自發(fā)縮足反射，持續(xù)近1 h，各組大鼠注射1 h內(nèi)自發(fā)縮足反射次數(shù)統(tǒng)計(jì)見表1。與對(duì)照組C1組比較，鞘內(nèi)注射嗎啡15μg／10μl組M1組大鼠1 h內(nèi)自發(fā)縮足反射次數(shù)顯著減少，證實(shí)鞘內(nèi)注射嗎啡對(duì)蜜蜂毒誘致的自發(fā)痛具有顯著性抑制作用（P＜0.05）；鞘內(nèi)同時(shí)給予嗎啡 15μg＋胍丁胺 12.5μg／10μl（AM1組）后，大鼠自發(fā)縮足反射次數(shù)進(jìn)一步減少，與M1組比較具有顯著性意義（P＜0.05）。提示鞘內(nèi)胍丁胺和嗎啡聯(lián)合用藥可顯著增強(qiáng)嗎啡對(duì)蜜蜂毒誘致自發(fā)痛的抑制作用，具有協(xié)同效應(yīng)。

Tab.1 The number of spontaneous flinches＼1 h after injection of BV in foot of rats（ˉx±s，n＝10）

2.2 胍丁胺聯(lián)合嗎啡對(duì)大鼠熱刺激潛伏期和機(jī)械性痛閾MPK的影響；

測(cè)量各組大鼠的熱刺激閾值和機(jī)械性痛閾測(cè)量結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2。M2組與對(duì)照組C2組比較熱刺激潛伏期顯著延長(zhǎng)，機(jī)械刺激閾值顯著提高（P＜0.05）。AM2組鞘內(nèi)注射嗎啡和胍丁胺后，大鼠的熱刺激閾值和機(jī)械性痛閾也明顯提高，與對(duì)照組C2組比較熱刺激潛伏期顯著延長(zhǎng)，機(jī)械刺激閾值顯著提高；與M2組比較熱刺激潛伏期和機(jī)械刺激閾值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這一結(jié)果提示鞘內(nèi)胍丁胺和嗎啡聯(lián)合用藥可增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用，具有加強(qiáng)鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

Tab.2 Changes of mechanical pain threshold，thermal stimulation incubation period and percentage of maximal possible effect of each group（ˉx±s，n＝10）

3 討論

胍丁胺（agmatine）是咪唑啉受體（imidazoline receptor，IR）的內(nèi)源性配體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在，通過作用于咪唑啉受體和α-腎上腺素受體，并且可能與阿片、N-甲基-M-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體在受體后相互作用，被認(rèn)為是一種新的神經(jīng)遞質(zhì)和／或神經(jīng)調(diào)質(zhì)［2，3］。有研究證實(shí)，胍丁胺本身有弱的鎮(zhèn)痛作用，雖然不延長(zhǎng)嗎啡的作用時(shí)間，但劑量依賴性增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛作用［4-6］；無論是對(duì)炎性疼痛或慢性神經(jīng)源性疼痛都產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。秦曉輝等［7］采用福爾馬林致痛模型研究發(fā)現(xiàn)，胍丁胺能顯著抑制大鼠足底注射福爾馬林誘致的自發(fā)縮足反射次數(shù)，并明顯增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛效果；咪唑啉受體拮抗劑咪唑克生不能拮抗胍丁胺鎮(zhèn)痛及增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛的作用；胍丁胺對(duì)脊髓谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的基礎(chǔ)釋放量和高鉀誘發(fā)谷氨酸和GABA釋放量的升高均沒有影響；因而認(rèn)為其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與咪唑啉受體無關(guān)，也不是通過在受體前水平抑制谷氨酸或促進(jìn)GABA釋放來實(shí)現(xiàn)的。王秀麗［8］等在神經(jīng)病理性痛大鼠模型研究中，同樣證實(shí)胍丁胺具有鎮(zhèn)痛作用，而且增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，抑制嗎啡耐受的形成。另有研究利用神經(jīng)病理性疼痛模型發(fā)現(xiàn)，胍丁胺能劑量依賴性地增加神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠痛閾，其受體機(jī)制可能與NMDA受體有關(guān)。

為了進(jìn)一步了解胍丁胺的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)采用炎性痛模型－蜜蜂毒實(shí)驗(yàn)，首次觀察了嗎啡聯(lián)合胍丁胺鞘內(nèi)注射對(duì)蜜蜂毒足底注射誘致自發(fā)縮足反射的作用，證實(shí)蛛網(wǎng)膜下腔給予胍丁胺能增強(qiáng)脊髓水平嗎啡對(duì)蜜蜂毒誘致自發(fā)痛反應(yīng)的抑制與以往研究結(jié)果一致。胍丁胺聯(lián)合嗎啡可以抑制蜜蜂毒誘致自發(fā)痛反應(yīng)，胍丁胺聯(lián)合嗎啡組自發(fā)縮足次數(shù)總數(shù)與單純嗎啡組比較，有明顯差異性，說明胍丁胺可以加強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛。

本實(shí)驗(yàn)通過鞘內(nèi)給藥，提示胍丁胺作為阿片類藥物輔助藥具有一定的可行性，極有可能成為椎管內(nèi)阿片類藥物良好的輔助劑；其次采用新型炎性痛模型——蜜蜂毒實(shí)驗(yàn)，在整體水平系統(tǒng)研究了胍丁胺對(duì)鞘內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證胍丁胺協(xié)同嗎啡鎮(zhèn)痛。

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