任 雪 程謨斌 張 業(yè) 沈珝琲

近年來，乳腺癌的發(fā)生率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅女性健康。越來越多的研究結(jié)果表明乳腺癌干細胞在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［1］。腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中往往也發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細胞獲得間葉細胞的特點，獲得腫瘤干細胞的特征［2］。MCF10A 是永生化的相對正常的乳腺上皮細胞系，其核型穩(wěn)定，接近二倍體，并且MCF10A 為雌激素受體陰性，沒有發(fā)生轉(zhuǎn)化，不具有成瘤性［3］。但是在特殊培養(yǎng)條件或體外誘導(dǎo)條件下，MCF10A 能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化，具有成瘤性［4］。利用MCF10A 構(gòu)建誘導(dǎo)分化模型，能夠模擬上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，為探究上皮細胞癌變過程中是否會產(chǎn)生乳腺癌干細胞奠定基礎(chǔ)。

本研究旨在構(gòu)建能夠被雌激素類似物他莫西芬激活的MCF10A - Er - Src 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，即MCF10A誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化模型，為乳腺癌相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.細胞:MCF10A 購自ATCC 細胞中心，HEK293T 為本組保存。

2.質(zhì)粒:pMSCV-FLAG -HA、pCMV -VSV -G、pCMV -Gga-Pol 和pCMV-3Tag-7 -hER 為本組保存，pLNCX chick v-src 購自Addgene 公司。

3.試劑:DMEM 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基和表皮生長因子EGF 購自Gibco 公司;馬血清、胎牛血清購自Biochrom AG公司;氫化可的松(hydrocortisone)、霍亂毒素(cholera toxin)、胰島素(insulin)、他莫西芬(Tamoxifen)、基因轉(zhuǎn)染增強劑(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)、FLAG 抗體和FLAG -Ezview M2 珠子購自Sigma 公司;p-c-Src(Tyr416)抗體、HA 抗體和β-actin 抗體購自Santa Cruz Biotech 公司;GAPDH 抗體購自Abcam 公司;內(nèi)切酶XhoⅠ、HpaⅠ、EcoRⅠ，Primer Star，dNTP Mix 和T4 DNA Ligase 購自TaKaRa 公司;Vigofect 轉(zhuǎn)染試劑購自威格拉斯公司;BCA 法測定蛋白濃度試劑盒購自Pierce 公司;辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG 和抗兔IgG 購自MBL公司。

4.細胞培養(yǎng):HEK293T 細胞系培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基(含10% 胎 牛 血 清、100μg/ml 青 霉 素 和100μg/ml 鏈 霉 素)。MCF10A 細胞系培養(yǎng)于DMEM/F12 培養(yǎng)基(含5%馬血清，20ng/ml EGF，0.5μg/ml hydrocortisone，100ng/ml cholera toxin，10μg/ml insulin，100μg/ml 青霉素和100μg/ml 鏈霉素)。培養(yǎng)條件均為37℃，5% CO2。構(gòu)建的MCF10A - Er - Src 和MCF10A-pMSCV 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系培養(yǎng)條件與MCF10A 相同。當穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系細胞匯合至50% 左右時，加入TAM 至終濃度1μmol/L 誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化。

5.質(zhì)粒構(gòu)建:以pCMV-3Tag-7 -hER 為模板，設(shè)計帶有XhoⅠ酶切位點和kozak 序列的hbER 正向引物:5' -CCGCTCGAGGCCACCAT GTCTGCTGGAGACATGA - 3'，帶 有HpaⅠ酶切位點的hbER 反向引物:5' - CCGGTTAACGA CCGTGGCAGGGAAACC-3'，進行PCR 反應(yīng);PCR 產(chǎn)物和pMSCV-FLAG -HA 空載經(jīng)XhoⅠ和HpaⅠ酶切后連接，構(gòu)建pMSCV-hbER-FLAG-HA。再以pLNCX chick v -src 為模板，設(shè)計帶有HpaⅠ酶切位點的Src 正向引物:5' - CCGGT TAACGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAA -3'，帶有EcoRⅠ酶切位點的反向引物:5' - CCGGAATTCGGCCTGCAGGTACTCAAAAGTG-3'，進行PCR 反應(yīng);PCR 產(chǎn)物和pMSCV -hbER-FLAG-HA 經(jīng)HpaⅠ和EcoRⅠ酶切后連接，構(gòu)建pMSCVhbER-Src-FLAG -HA。鑒定后大量制備質(zhì)粒于-20℃保存。

6.細胞轉(zhuǎn)染:按照威格拉斯公司Vigofect 高效轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

7.包裝病毒并感染MCF10A:將pMSCV - hbER - Src -FLAG-HA、pCMV-Gag-Pol 和pCMV-VSV-G 以7∶3∶1 的比例轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長至匯合度90%左右的HEK293T 細胞，轉(zhuǎn)染24h 后更換新鮮培養(yǎng)基4 ～5ml，并于換液24h 后收集培養(yǎng)基上清(含重組病毒)，含重組病毒的培養(yǎng)基與MCF10A 完全培養(yǎng)基1∶1混合，并加入Polybrene 至終濃度為8μg/ml，感染匯合度50% ～70%的MCF10A，在感染12h 后更換新鮮培養(yǎng)基，48h 后加入Puromycin 至終濃度4μg/ml，進行篩選。

8.基因組DNA 提取:收集細用胞并TE 重懸細胞(5 ×107個/毫升)，加入細胞裂解液(5 ×107個/10 毫升)。細胞裂解液配方:10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5% SDS，0.1mmol/L EDTA(pH 8.0)。加入蛋白酶K 至終濃度為100μg/ml，50℃過夜。向其中加入等體積酚，上下混勻10min，6500r/min 15min，重復(fù)酚抽提兩次，再氯仿/異戊醇抽提兩次。加入2 倍體積無水乙醇和0. 2 倍體積10mol/L NH4Ac，混勻，4℃，30min。用牙簽挑出DNA，70%乙醇洗滌兩次，晾干，TE 溶解，加入RNA 酶至終濃度為50μg/ml。測定基因組濃度。

9.基因組DNA PCR:根據(jù)反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架設(shè)計兩對PCR 引物。(1)正向引物:5' - CGCCAGTCCTCCGATAGA -3'，反向引物:5' - GTTCCAAACCGAAAGCAA -3'。(2)正向引物:5' - AATATGGGCCAAACAGGA - 3'，反向引物:5' -ACGCAGTCTATCGGAGGA-3'。以上述提取的基因組DNA為模板進行PCR 技術(shù)檢測。

10.蛋白提取及Western blot 法檢測:收集細胞并提取總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，一抗4℃孵育過夜(FLAG 抗體稀釋度為1∶10000，p - c - Src 抗體稀釋度1 ∶2000，HA 抗體稀釋度1∶2000，GAPDH 抗體稀釋度1 ∶5000，β - actin 抗體稀釋度1∶2000)，二抗室溫孵育1h(二抗稀釋度為1∶5000)，ECL 法顯影檢測蛋白表達。

11.免疫沉淀:將收集的細胞裂解液與抗FLAG M2 珠子4℃孵育過夜。離心棄上清，收集M2 珠子，并用冰預(yù)冷的TBS洗M2 珠子，4℃，8100 ×g 1min，共洗滌3 次。最后向M2 珠子中加入適量的SDS -PAGE 電泳上樣buffer，煮沸5min 變性，用于Western blot 法分析。

結(jié) 果

1.質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定:構(gòu)建得到的pMSCV -hbER-FLAG-HA 經(jīng)雙酶切法鑒定插入片段大小。XhoⅠ和HpaⅠ雙酶切后，電泳可見1.0kb 片段;pMSCV-hbER-Src-FLAG-HA 經(jīng)雙酶切法鑒定插入片段大小。Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后，電泳可見1.7kb 片段(圖1)，證明ER -Src 片段成功插入pMSCV - FLAG - HA 載體。將pMSCV - hbER - Src -FLAG-HA 質(zhì)粒送生工公司測序鑒定，無缺失和突變，證明ER-Src 表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pMSCV-hbER-FLAG-HA 和pMSCV-hbER-Src-FLAG-HA 的酶切鑒定

2.pMSCV- hbER - Src - FLAG - HA 質(zhì)粒的表達:將質(zhì)粒pMSCV-hbER -Src -FLAG -HA 和pMSCV-FLAG-HA 分別轉(zhuǎn)染匯合度為80% ～90%的HEK293T 細胞，6h 后更換新鮮培養(yǎng)基，48h 后收集細胞裂解液。使用FLAG、HA 抗體進行Western blot 法實驗，檢測pMSCV-hbER-Src -FLAG -HA 表達水平。結(jié)果顯示，pMSCV -hbER -Src -FLAG -HA 能夠在哺乳動物細胞中正常表達(圖2)。

圖2 pMSCV-hbER-Src-FLAG-HA 質(zhì)粒表達鑒定

3.MCF10A -Er -Src 細胞系構(gòu)建及鑒定:利用pMSCV-hbER-Src -FLAG -HA、pCMV -Gag -Pol和pCMV-VSV-G 構(gòu)建重組病毒，感染MCF10A，加入Puromycin 篩選細胞，初步獲得陽性細胞克隆。為了進一步鑒定細胞是否成功轉(zhuǎn)入ER-Src，進行基因組PCR 和Western blot 法實驗。提取細胞系基因組DNA，利用根據(jù)pMSCV -FLAG -HA 載體骨架設(shè)計的兩對引物，進行基因組PCR，分別得到大小約為500bp 和250bp 的片段，表明重組病毒的基因組片段成功整合到MCF10A 細胞。收集細胞系裂解液，Western blot 法實驗檢測ER-Src 融合蛋白表達。結(jié)果表明ER-Src 能夠在細胞中穩(wěn)定表達。以上結(jié)果證明MCF10A-Er -Src 細胞系和MCF10A -pMSCV細胞系構(gòu)建成功(圖3)。

圖3 MCF10A-Er-Src 穩(wěn)定細胞系鑒定

4.TAM 誘導(dǎo)MCF10A -Er-Src 轉(zhuǎn)化:當穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系匯合度為50%左右時，向細胞中加入TAM 至終濃度1μmol/L 進行誘導(dǎo)。36h 后收集細胞裂解液，用抗FLAG M2 珠子進行IP 實驗，IP 得到的樣品進行Western blot 法實驗。結(jié)果顯示TAM 誘使Src 發(fā)生了磷酸化(圖4A)。為進一步驗證Src 發(fā)生磷酸化的位點，用Src 特異位點磷酸化抗體p -c -Src(Tyr416)進行Western blot 法實驗，結(jié)果顯示Src 416 位酪氨酸發(fā)生磷酸化，證明Src 被激活。誘導(dǎo)36h 后停止TAM誘導(dǎo)，細胞系在正常培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)24h 后，收集細胞裂解液進行Western blot 法實驗。結(jié)果顯示TAM 誘導(dǎo)Src 激活后停止誘導(dǎo)，其磷酸化水平會顯著降低，證明Src 的激活作用依賴于TAM(圖4B)。TAM 誘導(dǎo)過程中，MCF10A -Er -Src 細胞系形態(tài)發(fā)生變化，細胞不再均勻貼壁生長而是呈集落生長，并相互疊層(圖4C)。證明MCF10A -Er -Src 在TAM誘導(dǎo)下發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

圖4 TAM 誘導(dǎo)MCF10A -Er-Src 分化

討 論

乳腺癌是女性惡性腫瘤中發(fā)生率以及病死率最高的腫瘤之一，且發(fā)病人群中年輕患者逐年增多。目前治療乳腺癌的手段主要有手術(shù)、化療、放療等，但是治療效果不佳，容易復(fù)發(fā)。越來越多的研究結(jié)果表明，腫瘤是由一群具有遺傳異質(zhì)性的細胞組成，其中一部分細胞具有干細胞樣的特點，能夠自我更新并分化，具有很高的致瘤性，并且對抗癌治療不敏感，這類細胞被稱作腫瘤干細胞［1，5，6］。因此，腫瘤干細胞在腫瘤的形成中起著重要的作用，很可能是腫瘤形成和轉(zhuǎn)移、治療效果不佳、預(yù)后差的關(guān)鍵原因?，F(xiàn)已經(jīng)證實多種惡性腫瘤中存在相應(yīng)的腫瘤干細胞，例如腦癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌以及黑色素瘤等［7～15］。隨著研究的進展，有理由認為腫瘤干細胞可能是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本原因。因此，構(gòu)建腫瘤干細胞誘導(dǎo)模型，對于探究腫瘤的形成，調(diào)控腫瘤的發(fā)生等方面有重要意義。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個重要的發(fā)育過程，目前很多研究表明在腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中往往也發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［16］。研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)永生化人乳腺表皮細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化，能夠使這些細胞獲得間葉細胞的特點，表達干細胞的分子標記，并具有很強的腫瘤形成能力，提示誘導(dǎo)乳腺上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，很可能使細胞獲得干細胞的特征［2］。據(jù)此猜測，在上皮細胞癌變過程中很可能也會產(chǎn)生腫瘤干細胞。

本研究利用MCF10A 構(gòu)建了MCF10A - Er -Src 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。添加雌激素類似物TAM 后其能夠與MCF10A-Er-Src 細胞系的雌激素受體結(jié)合，促使Src 發(fā)生二聚化，并磷酸化，進而激活下游通路(如NF - κB)，使MCF10A - Er - Src 發(fā) 生 轉(zhuǎn)化［17，18］。MCF10A 是永生化的乳腺上皮細胞系，在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中，細胞形態(tài)發(fā)生變化，由典型的上皮細胞的貼壁生長，向間葉細胞轉(zhuǎn)變，呈集落生長，已經(jīng)初步具備間葉細胞特征。根據(jù)文獻報道，MCF10A 發(fā)生轉(zhuǎn)化以后，細胞能夠在軟瓊脂中形成克隆，并且能夠在裸鼠成瘤實驗中形成腫瘤，流式分析其中部分細胞已經(jīng)具有乳腺癌干細胞標志CD24-CD44+，表明MCF10A 在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中獲得了乳腺癌干細胞的標志［19］。本研究為繼續(xù)研究細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細胞形成提供了重要依據(jù)，為揭示腫瘤形成和探究乳腺癌靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

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