顏 奇 王惠明 丁國華

B 細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在機體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮十分重要的作用。B 細胞通過抗原遞呈，T 細胞共活化，產(chǎn)生抗體，分泌細胞因子，形成對特定病原體的記憶性B 細胞等多方面來提高機體在抵御外來病原體入侵時的免疫能力［1］。B 細胞表面某些重要表面抗原在B 細胞存活和功能發(fā)揮中起至關(guān)重要的作用，其中一個關(guān)鍵的共刺激分子就是CD40。CD40 分子屬于腫瘤壞死因子受體TNFR 超家族中的1 個成員，它是位于20 號染色體上q12 ～q12.3 片段所編譯1 個(47 ～48)kDa 大小的Ⅰ類跨膜蛋白，由277 個氨基酸序列所構(gòu)成，分1 個170 個氨基酸序列組成的胞外段，1 個跨膜段和1 個短的胞內(nèi)段3 部分［2］。目前研究表明CD40 在諸多免疫細胞上均有表達，包括B細胞、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、單核細胞等，除免疫細胞外，其他細胞如血管上皮細胞，平滑肌細胞，成纖維細胞等也報道有CD40 的表達［3］。

既往研究表明CD40 分子對于B 細胞生理功能的發(fā)揮起重要的作用，B 細胞表面的CD40 分子在受到其配體CD40(CD40L)的結(jié)合后，表面CD40 分子將會聚集并內(nèi)化，定位于脂筏，其胞內(nèi)段與TRAFs 接頭蛋白相結(jié)合，形成一個信號復(fù)合體，進一步聚集信號通路中的一系列激酶如NF -κB 誘導(dǎo)激酶(NIK)、NF-κB 激活因子-1(Act -1)、受體結(jié)合激酶RIP和MAPK 通路中的激酶，產(chǎn)生信號級聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致一系列信號通路的活化。CD40 誘導(dǎo)可活化的信號通路包括:經(jīng)典或非經(jīng)典的NF - κB 通路，MAPK激酶p38、Erk 和Jnk 通路，PI3K 通路以及STAT3 通路等。這些信號通路的激活進一步活化B 細胞并介導(dǎo)B 細胞一系列生理功能。MAPK 和NF -κB 信號通路介導(dǎo)了CD40 誘導(dǎo)的B 細胞增殖、活化、抗體Ig類別轉(zhuǎn)換，細胞因子分泌等功能，并使B 細胞免于CD40L 誘導(dǎo)的細胞凋亡。PI3K 和STAT 通路的激活則可能參與B 細胞抗凋亡能力，并能夠上調(diào)ICAM1、CD23 和淋巴毒素-1 的表達［4］。

支架蛋白c -Jun NH2 -terminal kinase -associated leucine zipper protein (JLP)為p38 和Jnk MAPK信號通路中的1 個支架蛋白，它由Reddy 小組于2002 年首次發(fā)現(xiàn)，后續(xù)的一系列研究報道了JLP 在神經(jīng)細胞中的對細胞胞膜和胞質(zhì)的囊泡轉(zhuǎn)運重要調(diào)控作用［5］。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)支架蛋白JLP 可以調(diào)控樹突狀細胞(DC)表面CD40 分子的跨膜穿梭轉(zhuǎn)運［6］。如上所述，CD40 分子誘導(dǎo)的信號通路激活在B 細胞的生物學(xué)功能的發(fā)揮中起重要作用，然而關(guān)于支架蛋白JLP 在CD40 誘導(dǎo)免疫細胞的信號通路及后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)作用的探討國內(nèi)外目前尚無研究報道，本研究中使用jlp 基因敲除小鼠脾臟B 細胞來研究以上問題，以期進一步探索支架蛋白JLP 在免疫細胞中發(fā)揮的一系列的作用。

材料與方法

1.材料:(1)實驗動物:jlp 雜合基因(jlp+/-)C57/BL6背景小鼠由日本金澤大學(xué)Katsuji Yoshioka 教授惠贈，小鼠飼養(yǎng)并繁殖于武漢大學(xué)動物實驗中心，實驗所用小鼠均為SPF級別。jlp 野生型(jlp+/+)和jlp 敲除(jlp-/-)小鼠均由jlp+/-小鼠繁殖所得，使用PCR 及免疫印跡法對繁殖小鼠后代進行基因鑒定，下述實驗均使用同窩中體重和性別匹配的jlp+/+和jlp-/-小鼠進行。(2)細胞培養(yǎng):小鼠脾淋巴細胞分離液購自北京達科為公司;B 細胞分選所用分選溶液、分選用Cocktail antibody、鏈霉素偶聯(lián)磁珠、磁架均來自美國BD 生物公司;RPMI1640 細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自Life Gibco 公司，1%青霉素鏈霉素溶液購自北京吉泰公司。(3)試劑:重組小鼠CD40 配體蛋白購自美國R＆D 公司，CFSE 細胞增殖檢測試劑盒購自Life Molecular probes 公司，p38、Jnk MAPK 通路特異性激動劑Anisomycin 購自美國Sigma-Aldrich 公司，0.45μm PVDF 膜購自Merck Millipore 公司，遠紅外抗小鼠及抗兔IRDye 800CW 二抗購自Li -cor 公司，抗Erk，抗Jnk，抗p38，抗磷酸化Erk (Thr202/Tyr204)，抗磷酸化Jnk (Thr183/Tyr185)，抗磷酸化p38 (Thr180/Tyr182)，抗磷酸化IκBα (Ser32)，抗磷酸化c -Jun (Ser73)抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。(4)儀器:流式細胞儀Accuri C6 購自美國BD 公司;奧德賽近紅外激光掃描系統(tǒng)Odyssey CLx Infrared Imaging System (Li-Cor 公司)，本部分實驗在武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室完成。

2.方法:(1)B 細胞磁珠分選:無菌取出脾臟，200 目濾網(wǎng)碾磨、過濾脾臟獲得單個細胞，將細胞重懸于淋巴細胞分離液中，水平離心800 ×g，30min 小心吸取中間白膜層，即為脾臟淋巴細胞。洗滌并裂紅后重懸細胞于磁珠分選液中，計數(shù)所得脾臟淋巴細胞后每1 ×106個/毫升細胞數(shù)加入小鼠B 淋巴細胞陰性分選cocktail 5μl，冰上孵育15min，洗滌細胞懸液后加入鏈霉素偶聯(lián)磁珠，4℃反應(yīng)30min 后過磁架，即為陰性分選所得B 細胞。使用流式細胞儀計數(shù)B 細胞分選純度，本實驗中B 細胞分選純度為88% ～95%。(2)免疫印跡:使用Life預(yù)制膠系統(tǒng)進行電泳，恒壓80V，30min 后轉(zhuǎn)100V 2 ～3h，待Marker 分開后關(guān)閉電源結(jié)束電泳。配制電轉(zhuǎn)液1L (Tris -base 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml)，調(diào)整電轉(zhuǎn)儀200mA 1 ～2h，低分子如β-actin 1h 即可，高分子一般需2h 電轉(zhuǎn)時間;電轉(zhuǎn)完成后，取出PVDF 膜放置TBS 中洗滌5min，將PVDF 膜加入TBST 配制5%的脫脂奶粉溶液(封閉液)，搖床孵育1h，將封閉好的PVDF 膜放入相應(yīng)一抗內(nèi)，于4°冰箱過夜。第2 天，取出PVDF 膜于TBST 中放置搖床上洗滌3 次，每次5min，洗滌完畢后加入二抗，室溫下反應(yīng)1h。二抗反應(yīng)完畢后同樣以TBST 置搖床上洗滌3 次，每次5min。使用奧德賽近紅外激光掃描系統(tǒng)對PVDF 膜進行曝光，并使用配套軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。(3)CFSE 染色:調(diào)整B 細胞濃度為107個/毫升，離心后重懸于500μl 含0.1% BSA 的PBS 內(nèi)，加入CFSE(終濃度為5μmol/L)后將細胞懸液置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8min;孵育結(jié)束后加入4℃預(yù)冷20% FBS 完全培養(yǎng)基離心洗滌1500r/min。10min，3 遍;加入rCD40L(1μg/μl)于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 天。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞上流式細胞儀于FL1 通道上檢測CFSE 熒光改變。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組之間的數(shù)據(jù)使用t 檢驗，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩種不同基因型B 細胞CD40L 誘導(dǎo)信號通路激活情況:筆者首先探索支架蛋白JLP 對CD40L 誘導(dǎo)活化B 細胞信號通路的作用。通過免疫印跡法檢測信號通路中蛋白磷酸化水平改變來對信號通路的活化進行分析。筆者發(fā)現(xiàn)jlp-/-B 細胞的p38、Erk和Jnk MAPK 通路的磷酸化水平表達較jlp+/+B 細胞有明顯的降低，同時Jnk 下游通路中磷酸化c -Jun表達水平同樣受到了抑制，表明支架蛋白JLP 的缺失使CD40 誘導(dǎo)B 細胞MAPK 信號通路的活化受到限制。然而我們觀察到IκBα 的磷酸化水平在兩種基因型的B 細胞上未存在明顯差異(圖1)。

圖1 jlp + / +和jlp - / -B 細胞給予不同時間段CD40L 的刺激后，收集細胞進行免疫印跡Western blot 法檢測p38、Erk、Jnk 及其磷酸化形式，磷酸化IκBα、磷酸化c-Jun 的改變情況

2.anisomycin 誘導(dǎo)jlp+/+和jlp-/-B 細胞p38 和Jnk 信號通路活化改變:因為JLP 為p38 和Jnk 通路中的一個支架蛋白，為了進一步明確jlp-/-B 細胞其MAPK 信號通路減弱是固有支架蛋白JLP 缺失還是CD40 誘導(dǎo)特異性所致，本研究使用p38 和Jnk MAPK 通路特異性激動劑anisomycin 來誘導(dǎo)兩種不同基因型B 細胞p38 和Jnk 通路的磷酸化，并比較兩者磷酸化程度的差異。anisomycin 刺激后，jlp+/+和jlp-/-B 細胞的p38 和Jnk 磷酸化水平并未發(fā)生改變(圖2)。

3.CD40L 誘導(dǎo)兩種基因型B 細胞增殖率:CFSE結(jié)果表明，兩種基因型B 細胞在未接受刺激時其增殖情況無明顯差異，在給予CD40L 刺激5 天后，jlp+/+B 細胞增殖率為54.8%，而jlp-/-B 細胞增殖率則明顯下降，僅為17.4%(圖3)。

圖2 兩種不同基因型B 細胞給予不同時間段anisomycin(250ng/ml)刺激后，收集細胞進行免疫印跡Western blot 法檢測p38、Jnk 及其磷酸化形式的改變情況

圖3 兩種不同基因型的B 細胞先給予CFSE 染色，染色完畢后細胞再不給予Medium 或給予CD40L 培養(yǎng)5 天，5 天后收集細胞進行流式熒光染色，圈門的CD19 + B 細胞使用流式細胞儀的第1 通路檢測CFSE 熒光表達情況

討 論

CD40 誘導(dǎo)的信號通路對于B 細胞存活及發(fā)揮正常生理功能具有非常重要的作用，其中NF-κB 和MAPK 信號通路廣泛報道與B 細胞發(fā)揮生物學(xué)功能密切相關(guān)，NF-κB 和MAPK 信號通路的激活參與B細胞存活、活化、增殖、分泌免疫球蛋白、產(chǎn)生記憶性B 細胞等一系列生理過程，然而目前關(guān)于CD40 誘導(dǎo)這些信號通路的具體分子機制尚未研究透徹［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，支架蛋白JLP 參與調(diào)控CD40 誘導(dǎo)MAPK信號通路的過程，而對CD40 誘導(dǎo)NF-κB 通路的激活影響不大。JLP 并未通過其固有p38 和Jnk 通路中支架蛋白的缺失介導(dǎo)MAPK 通路的激活減弱，提示支架蛋白JLP 特異性地在CD40L 誘導(dǎo)B 細胞MAPK 信號通路的活化中發(fā)揮重要作用。此外，筆者也觀察到JLP缺失導(dǎo)致CD40 誘導(dǎo)B 細胞的增殖水平明顯降低。

CD40 在受到CD40L 刺激后，表面CD40 分子將聚集于脂筏區(qū)，并在此募集一系列TRAFs 接頭蛋白，而TRAFs 接頭蛋白在CD40 誘導(dǎo)的下游信號通路中發(fā)揮十分重要作用。TRAFs 有1 ～6 個成員，其中TRAF2、3、6 參與CD40 誘導(dǎo)下游MAPK 信號通路的激活，而TRAF1、2、3、5、6 均報道可介導(dǎo)CD40 誘導(dǎo)下游NF-κB 通路的激活［7］。在本研究中JLP 缺失降低了CD40 誘導(dǎo)MAPK 通路的活性，本實驗中使用p38 和Jnk 通路特異性激動劑作用后并未發(fā)現(xiàn)JLP 缺失對B 細胞p38 和Jnk 通路產(chǎn)生影響，在另一個研究中同樣發(fā)現(xiàn)在給予UV 照射和滲透壓應(yīng)激后JLP 缺失的成纖維細胞其Jnk 通路活化未發(fā)生明顯差異，這提示固有JLP 支架蛋白的缺失并不會導(dǎo)致p38 通路和Jnk 通路活化減弱［8］。綜合以上結(jié)果表明JLP 缺失產(chǎn)生CD40 特異性誘導(dǎo)B 細胞MAPK 通路激活減弱并非為其通路固有支架蛋白JLP 的缺失所致，提示可能存在其他機制導(dǎo)致MAPK 信號通路活化的減弱。一個可能性為支架蛋白JLP 的缺失致使CD40和TRAFs 的結(jié)合減弱所導(dǎo)致，進而影響下游信號通路的激活;我們前期研究發(fā)現(xiàn)使用shRNA 干擾JLP表達后阻滯了樹突狀細胞表面CD40 分子的內(nèi)化，而CD40 內(nèi)化是啟動下游信號通路的一個必要途徑，JLP的缺失是否阻滯了B 細胞上CD40 內(nèi)化進而影響下游信號通路則有待進一步研究證實［6］。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，支架蛋白JLP 介導(dǎo)CD40 誘導(dǎo)的B 細胞增殖。既往研究表明，B 細胞上Jnk 信號通路活化后可以進一步激活下游c-Jun 信號分子，而c-Jun 信號分子參與了AP -1 轉(zhuǎn)錄因子的形成，Jnk 依賴的AP-1 轉(zhuǎn)錄因子的活化對于B 細胞增殖起重要作用［9］。在本研究中JLP 缺失降低了Jnk 信號通路以及下游c-Jun 信號分子活化程度，而這也與后續(xù)本實驗觀察到的jlp-/-B 細胞增殖水平的降低相關(guān)。大量研究表明NF -κB 通路的激活同樣可以導(dǎo)致B細胞增殖［10］。本實驗中未觀察到支架蛋白JLP 對NF-κB 通路活化的影響作用，支架蛋白JLP 缺失對于CD40 誘導(dǎo)B 細胞NF -κB 通路的活化沒有明顯的影響，這提示JLP 缺失所致B 細胞增殖減弱并未通過NF-κB 通路依賴的細胞增殖途徑所致。

本實驗中觀察到，JLP 缺失僅導(dǎo)致了CD40 誘導(dǎo)MAPK 通路活化程度的降低，而對NF -κB 通路的激活無明顯影響，有研究報道在B 細胞淋巴瘤上CD40定位于脂筏并形成的CD40 信號小體是NF-κB 通路激活的一個重要步驟，這提示CD40 的脂筏定位參與了NF-κB 通路的活化，而另一篇文章則發(fā)現(xiàn)B 細胞上MAPK 信號通路的活化并不依賴于CD40/脂筏定位的參與，這表明MAPK 和NF -κB 兩種信號通路的激活可能通過不同途徑來實現(xiàn)［11］。既往研究表明，在血管上皮細胞中CD40 內(nèi)化后可以進一步定位于Rab5+核內(nèi)體，而CD40/Rab5 + 核內(nèi)體的定位在CD40 誘導(dǎo)的信號通路中的作用目前尚不明確，支架蛋白JLP 介導(dǎo)的MAPK 通路激活是否通過CD40/Rab5+核內(nèi)體的定位來實現(xiàn)有待本課題組后續(xù)實驗驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，支架蛋白JLP 參與調(diào)控B 細胞上CD40 誘導(dǎo)MAPK 信號通路的活化，并對后續(xù)B 細胞的增殖水平產(chǎn)生影響。目前關(guān)于支架蛋白在免疫細胞中的作用知之甚少，未來則需要更多的研究來對其進一步深入地探索。

1 Khan WN，Wright JA，Kleiman E，et al. B -lymphocyte tolerance and effector function in immunity and autoimmunity［J］. Immunol Res，2013，57(1 -3):335 -353

2 Elgueta R，Benson MJ，de Vries VC，et al. Molecular mechanism and function of CD40/CD40L engagement in the immune system［J］.Immunol Rev，2009，229(1):152 -172

3 Chatzigeorgiou A，Lyberi M，Chatzilymperis G，et al. CD40/CD40L signaling and its implication in health and disease［J］. Biofactors，2009，35(6):474 -483

4 Graham JP，Arcipowski KM，Bishop GA. Differential B-lymphocyte regulation by CD40 and its viral mimic，latent membrane protein 1［J］. Immunol Rev，2010，237(1):226 -248

5 Ikonomov OC，F(xiàn)ligger J，Sbrissa D，et al. Kinesin adapter JLP links PIKfyve to microtubule-based endosome-to-trans-Golgi network traffic of furin［J］. J Biol Chem，2009，284(6):3750 -3761

6 Wang H，Zhao C，Zhang M，et al. A novel role of the scaffolding protein JLP in tuning CD40 -induced activation of dendritic cells［J］.Immunobiology，2013，218(6):835 -843

7 Bishop GA，Moore CR，Xie P，et al. TRAF proteins in CD40 signaling［J］. Adv Exp Med Biol，2007，597:131 -151

8 Iwanaga A，Wang G，Gantulga D，et al. Ablation of the scaffold protein JLP causes reduced fertility in male mice［J］. Transgenic Res，2008，17(6):1045 -1058

9 Gallagher E，Enzler T，Matsuzawa A，et al. Kinase MEKK1 is required for CD40 - dependent activation of the kinases Jnk and p38，germinal center formation，B cell proliferation and antibody production［J］. Nat Immunol，2007，8(1):57 -63

10 Hostager BS，Bishop GA. CD40 - Mediated Activation of the NF -kappaB2 Pathway［J］. Front Immunol，2013，4:376

11 Nadiri A，Polyak MJ，Jundi M，et al. CD40 translocation to lipid rafts:signaling requirements and downstream biological events［J］.Eur J Immunol，2011，41(8):2358 -2367