袁赤亭 雷新環(huán) 洪 盾

骨肉瘤是最常見(jiàn)成骨的惡性腫瘤，約占骨惡性腫瘤的20%左右，其特點(diǎn)是惡性程度高、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差。骨肉瘤細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲是造成預(yù)后差的主要原因之一，而骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移與細(xì)胞黏附分子及細(xì)胞骨架等方面有關(guān)。上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞游走和遷徙;細(xì)胞骨架包括波形蛋白(vimentin)和β -連環(huán)蛋白(β -catenin)，這兩種分子跟腫瘤細(xì)胞侵襲力和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);這3 種蛋白均屬于EMT 標(biāo)志物，其中EMT 還包括細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等成分。近幾年越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)EMT 標(biāo)志物與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，逐漸受到大家的重視，成為骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究方面熱點(diǎn)之一［1］。

一、EMT 概念

EMT 即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞在某些生理和特定病理情況下，上皮細(xì)胞改變表型，失去極性，向無(wú)極性的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而獲得浸潤(rùn)、活動(dòng)及游走等能力的現(xiàn)象，這概念首先是Greenberg 和Hay 在1982 年首次提出的概念。此過(guò)程包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和基因型改變，且研究發(fā)現(xiàn)這些變化與組織纖維化、胚胎形成和發(fā)育及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等有著密切關(guān)系。EMT 過(guò)程中相關(guān)基因型改變?nèi)缦拢?］:①細(xì)胞表面蛋白:包括上皮性鈣黏蛋白(E -cadherin)和神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)等，其中E -cadherin 是最重要一個(gè)，是維持上皮細(xì)胞表型和極性的重要分子，在EMT 過(guò)程表達(dá)下降;②細(xì)胞骨架:包括波形蛋白(vimentin)、細(xì)胞角蛋白、α -平滑肌肌動(dòng)蛋白和β-連環(huán)蛋白(β -catenin)等，vimentin 和β - catenin是較重要兩個(gè)成分，是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，在EMT 過(guò)程表達(dá)升高;③細(xì)胞外基質(zhì):主要代表為纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，在EMT 過(guò)程表達(dá)升高，是一個(gè)非特異性指標(biāo);④轉(zhuǎn)錄因子:Snai1、Slug 和Twist 等在EMT 過(guò)程中表達(dá)均升高。因此研究者根據(jù)EMT 標(biāo)志物和細(xì)胞形態(tài)改變來(lái)評(píng)估EMT 與某些疾病的關(guān)系。

EMT 根據(jù)不同功能被分為3 種類(lèi)型［3］。Ⅰ型主要發(fā)生在原腸胚胎形成和神經(jīng)嵴細(xì)胞形成。Ⅱ型主要與傷口愈合、組織再生、炎癥和纖維化發(fā)生有關(guān)。Ⅲ型主要發(fā)生在上皮性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為遷移性間質(zhì)性癌細(xì)胞，使癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

二、EMT 相關(guān)標(biāo)志物的特點(diǎn)及與骨肉瘤相關(guān)性

1.E-cadherin:E -cadherin 是一種鈣黏蛋白中細(xì)胞黏附分子，該基因位于16q22.1 區(qū)域，分子質(zhì)量為124kDa 左右，為單鏈Ⅰ型跨膜蛋白，具有鈣黏蛋白特點(diǎn)，分為胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、胞膜外區(qū)等3 部分。該分子中氨基末端(N 端)位于胞膜外，與鈣結(jié)合部位;羥基末端(C 端)位于胞質(zhì)內(nèi)，與細(xì)胞骨架相連，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，甚至細(xì)胞核，產(chǎn)生相關(guān)的生物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞外中鈣離子存在時(shí)，才能激活E -cadherin 分子，使胞內(nèi)游離C 端與連環(huán)蛋白(catenin)結(jié)合，形成E-cadherin -catenin 復(fù)合物;研究者還發(fā)現(xiàn)E-cadherin 胞質(zhì)內(nèi)C 端有游離型和結(jié)合型，結(jié)合型主要是E -cadherin -catenin 復(fù)合物，游離型和結(jié)合型處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)平衡發(fā)生變化時(shí)，將發(fā)生一系列不同生物學(xué)效應(yīng)，當(dāng)平衡趨向結(jié)合型，細(xì)胞黏附力增加。反之，與細(xì)胞骨架相連發(fā)生改變，細(xì)胞間連接減少，導(dǎo)致黏附力減弱，細(xì)胞活動(dòng)力和侵襲力增強(qiáng)。

研究表明E-cadherin 與某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，目前研究較成熟的是E -cadherin 與乳腺癌、胃癌等腫瘤，與骨肉瘤方面較少，但近年來(lái)研究逐漸增多。Yin 等［4］研究107 例骨肉瘤患者發(fā)現(xiàn)E-cadherin 在成骨性、成軟骨性及成纖維性等3 種不同類(lèi)型骨肉瘤組織中表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在未轉(zhuǎn)移骨肉瘤中陽(yáng)性率遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)移的，以及E -cadherin 陽(yáng)性患者術(shù)后生存率比陰性高，因此他們推測(cè)骨肉瘤中E-cadherin 表達(dá)高低可能與腫瘤類(lèi)型、骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后等情況有關(guān)。Niinaka 等［5］研究發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition，MET)后抑制了骨肉瘤細(xì)胞株LM8 生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)MET 后E-cadherin 表達(dá)升高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，筆者認(rèn)為E-cadherin 表達(dá)強(qiáng)弱與骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，但在E -cadherin 基因敲除前后骨肉瘤細(xì)胞侵襲力變化目前暫無(wú)相關(guān)報(bào)道，其作用機(jī)制也未明確，需要進(jìn)一步研究。

2.vimentin:vimentin 是細(xì)胞骨架的中間纖維家族中重要成員之一，編碼vimentin 基因位于10p13，分子質(zhì)量大小為57kDa 左右，該蛋白單體分為3 部分:頭部氨基端(N)、尾部的羧基端(C)及兩端之間螺旋桿狀區(qū)。兩個(gè)單體相互扭曲形成二聚體，進(jìn)一步形成四聚體，與其他四聚體構(gòu)成波形蛋白絲，并與微絲及微管共同形成了一個(gè)細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)而維持細(xì)胞完整性。vimentin 在不同腫瘤組織表達(dá)不同，主要受vimentin表達(dá)上調(diào)和下調(diào)機(jī)制調(diào)節(jié)。上調(diào)機(jī)制主要跟GC 盒、核因子-κB(NF-κB)、反義沉默子(ASE)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF -β)等有關(guān)，這些因子均促進(jìn)vimentin 表達(dá)升高;下調(diào)機(jī)制主要通過(guò)ZBP -89 結(jié)合vimentin 啟動(dòng)子附近的序列，從而抑制vimentin 表達(dá)。vimentin 表達(dá)升高或下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞功能有著重要密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤中vimentin 表達(dá)高低與侵襲力強(qiáng)弱呈正比［6］。Zhang 等［7］研究者通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)骨肉瘤標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中高表達(dá)vimentin，跟骨肉瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。Niinaka 等［5］研究發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞株MG63 中AMF/PGI 被沉默后轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞后，vimentin 表達(dá)明顯下降及侵襲力減弱。同時(shí)，人成骨細(xì)胞株LM8 中AMF/PGI 被沉默前后，vimentin 表達(dá)高低與侵襲力較強(qiáng)弱呈正相關(guān)性?？傊鶕?jù)目前研究發(fā)現(xiàn)vimentin 在不同類(lèi)型骨肉瘤中表達(dá)不同，但與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性未明確。

3.β-catenin:β -catenin 是一種黏附分子相關(guān)的可溶性蛋白，編碼該基因位于染色體3p21、3p22，分子質(zhì)量約92kDa。該蛋白分成3 部分:N 端結(jié)構(gòu)域、C 端結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)域。N 端結(jié)構(gòu)域含有糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和酪氨酸蛋白激酶(PTK)的磷酸化位點(diǎn)，后者是catenin 結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)維持β -catenin 穩(wěn)定性具有重要作用。C 端結(jié)構(gòu)域含有T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)激活下游基因轉(zhuǎn)錄起到關(guān)鍵作用;中間區(qū)域包括Arm 區(qū)域，還有E - cadherin、APC 等結(jié)合位點(diǎn)，共同參與Wnt 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。β -catenin 主要以復(fù)合物形式存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，細(xì)胞膜中β -catenin 與E -cadherin 胞內(nèi)C 端結(jié)合，再通過(guò)α -catenin 與細(xì)胞骨架相關(guān)分子結(jié)合，形成E -cadherin -catenin -細(xì)胞骨架分子復(fù)合物，參與細(xì)胞黏附、遷移等功能;細(xì)胞質(zhì)中β -catenin 被GSK-3β 和PTK 磷酸化后，逐漸被降解，同時(shí)胞質(zhì)中會(huì)不斷合成新β-catenin 分子，始終保持合成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如果有些因素導(dǎo)致磷酸化過(guò)程發(fā)生異常，引起β-catenin 在胞質(zhì)大量積累，導(dǎo)致Wnt/β-catenin 通路相關(guān)基因被激活或抑制，從而出現(xiàn)不同疾病。

近年來(lái)關(guān)于骨肉瘤與β -catenin 表達(dá)及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)性相繼展開(kāi)。Yang 等［8］研究54 例骨肉瘤患者后發(fā)現(xiàn)N -cadherin 表達(dá)減弱，β -catenin 表達(dá)異常升高，且β - catenin 表達(dá)與轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。Jin 等［9］研究表明誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)完成，以上研究提示骨肉瘤中β-catenin 表達(dá)高低與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡有關(guān)，而這些功能變化可能通過(guò)Wnt/β -catenin 信號(hào)通路來(lái)完成。Xia 等［10］通過(guò)siRNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)，將MG63 細(xì)胞中β -catenin 基因沉默后，經(jīng)塞來(lái)昔布處理后，發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布是通過(guò)激活GSK-3β 和抑制β -catenin 依賴(lài)性基因來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞株MG63 生存能力;Zhang 等［11］研究骨肉瘤細(xì)胞株MG63 中β - catenin基因被沉默后，發(fā)現(xiàn)MG63 侵襲力和活動(dòng)力明顯下降，以及MG63 對(duì)多柔比星藥物敏感度減弱，因此他們認(rèn)為骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲和對(duì)多柔比星敏感度均與β-catenin 有關(guān)?？傊?-catenin 基因表達(dá)高低可能與骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性有關(guān)，但β -catenin在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具體作用機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步研究探討。

4.纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N):FN 是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分之一，該基因定位于人染色體2q34 ～36，F(xiàn)N 是由兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的雙股多肽高分子糖蛋白，兩股肽鏈分子質(zhì)量各約220kDa。正常情況下，F(xiàn)N 廣泛存在于皮下基膜、平滑肌細(xì)胞及疏松組織，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和增加細(xì)胞間連接等多種生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移時(shí)，F(xiàn)N 表達(dá)較正常組織明顯升高。近年來(lái)研究FN 與骨肉瘤相關(guān)性越來(lái)越多，Na 等［12，13］對(duì)65 例低分化骨肉瘤、20 例高分化骨肉瘤、7 例骨樣骨瘤及7 例正常骨組織中FN 表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FN 在不同組織中表達(dá)高低不同，在低分化骨肉瘤最高(44.6%)，在正常骨組織無(wú)表達(dá);FN 在各種類(lèi)型骨肉瘤中陽(yáng)性率也不同，在成骨性骨肉瘤陽(yáng)性表達(dá)最高(75.9%);FN 在轉(zhuǎn)移骨肉瘤中表達(dá)(65.5%)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移(34.5%);FN 陽(yáng)性患者比陰性的生存能力差及生存時(shí)間短。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，他們推測(cè)骨肉瘤中FN 表達(dá)與轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系。因此筆者推測(cè)FN 可能與骨肉瘤分型、轉(zhuǎn)移、侵襲及治療有關(guān)。

5.Snail 超家族:Snail 超家族是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的 DNA 結(jié)合蛋白，包括Snail1 (Snail)、Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)等3 個(gè)，Snail1 和Snail2 較為重要，兩者在EMT 中功能相當(dāng)［3］。Snail 超家族是調(diào)控EMT 重要轉(zhuǎn)錄因子之一，具有提高FN 及vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物和抑制E-cadherin 及細(xì)胞角蛋白等上皮細(xì)胞標(biāo)志物的功能［3］。Snail 超家族調(diào)節(jié)EMT作用機(jī)制如下:Snail 超家族通過(guò)與Smad 相互作用蛋白(SIP-1)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)結(jié)合E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)域的E盒，抑制E-cadherin 和細(xì)胞角蛋白等分子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin 表達(dá)下降和vimentin 表達(dá)升高，從而引起EMT 發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)Snail 表達(dá)增高與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后有著密切關(guān)系。Yang 等［14］通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)抑制Snail1基因后，引起骨肉瘤細(xì)胞凋亡及侵襲力減弱，他們認(rèn)為Snail1 基因可能與骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Sharili 等［15］對(duì)犬和貓骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Snail2 在3 種不同分化能力骨肉瘤中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在低分化中表達(dá)最高，在高分化中表達(dá)最低;Snail2 在不同類(lèi)型骨肉瘤中表達(dá)也存在明顯差異，在成骨肉瘤中表達(dá)最高。他們推測(cè)Snail2 可能是作為診斷骨肉瘤標(biāo)志物之一。Sharili 等［16］研究Saos -2細(xì)胞中Snail2 基因被敲除后，Saos -2 細(xì)胞活動(dòng)力減少，細(xì)胞骨架發(fā)生改變及細(xì)胞突處減少;使Saos -2細(xì)胞高表達(dá)Snail2 基因后，Saos-2 細(xì)胞活動(dòng)力增加，細(xì)胞突處增加。因此他們推測(cè)Snail2 可能是臨床骨肉瘤潛在治療靶點(diǎn)。

6.Twist:Twist 是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，最早是1983 年在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)及研究較多一種轉(zhuǎn)錄因子，是通過(guò)E -box 相關(guān)元素來(lái)調(diào)節(jié)許多靶基因表達(dá)。Twist 基因位于7p21.2，由于羥基末端不同，人Twist 分為T(mén)wist1 和Twist2，Twist1常稱(chēng)為T(mén)wist。Twist 調(diào)控EMT 參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移是目前研究的焦點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)Twist 可以促進(jìn)Snail 表達(dá)，從而使E - cadherin 表達(dá)增強(qiáng)，以及FN 和N -cadherin 表達(dá)減弱，導(dǎo)致EMT 發(fā)生。Twist 在骨肉瘤方面研究還處于早期階段，相關(guān)研究相繼展開(kāi)。Entz等［17］研究發(fā)現(xiàn)Twist 與低分化骨肉瘤有明顯相關(guān)性，推測(cè)可能作為檢測(cè)骨肉瘤的基因標(biāo)志物。Yin 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，Twist 在成骨性骨肉瘤中表達(dá)最高(38.6%)，在成纖維性中無(wú)表達(dá)，Twist 在轉(zhuǎn)移中表達(dá)(52.8%)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移(33.3%)。根據(jù)化療效果來(lái)比較Twist 表達(dá)情況，化療效果好的患者Twist陽(yáng)性表達(dá)率為30.6%，化療效果差的患者Twist 陽(yáng)性表達(dá)率為33.3%。根據(jù)隨訪(fǎng)后生存率比較，陽(yáng)性患者術(shù)后各時(shí)間段生存率較低。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，他們推測(cè)骨肉瘤中Twist 表達(dá)高低與腫瘤類(lèi)型有關(guān)，還與骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移及生存率呈正比，但與化療效果相關(guān)性及具體作用機(jī)制均未明確。

三、展 望

目前文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)是關(guān)于臨床骨肉瘤標(biāo)本及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與EMT 關(guān)系，基本停留在EMT 在骨肉瘤表達(dá)及轉(zhuǎn)移、侵襲方面，而EMT 在骨肉瘤中相關(guān)作用機(jī)制未明確，以及EMT 與骨肉瘤患者化療之間關(guān)系研究極少，至今仍存在很多的爭(zhēng)議之處。原因是在體內(nèi)發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的骨肉瘤細(xì)胞只占原發(fā)腫瘤的很少一部分，當(dāng)骨肉瘤發(fā)生EMT 時(shí)的一些基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白水平的改變往往為原發(fā)腫瘤所掩蓋。如何確定和判斷骨肉瘤已經(jīng)發(fā)生EMT 是一個(gè)很難的問(wèn)題。實(shí)際上體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移經(jīng)歷EMT 和MET 兩個(gè)過(guò)程，兩個(gè)處于動(dòng)態(tài)過(guò)程。因此EMT 相關(guān)分子、動(dòng)物模型及人體研究有望成為骨肉瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，為骨肉瘤早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供價(jià)值，并且有望為骨肉瘤治療提供新的靶點(diǎn)。

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