王瑩瑩 劉玉 姬妍茹 張正海 周廣麒 劉宇峰

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034；2.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，大慶 163319）

二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）是催化三酰甘油（TAG）合成最后一步的反應(yīng)酶，也是其合成過(guò)程中唯一的限速酶［1］，對(duì)油脂合成代謝起到正調(diào)控作用［2］，具有促進(jìn)TAG 積累的作用［3］。DGAT 廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，迄今為止發(fā)現(xiàn)該酶 存 在4 種 類 型：DGAT1、DGAT2、WS/DGAT 和CytoDGAT［4］。近年來(lái)研究表明，大量表達(dá)編碼該酶的基因可以明顯提高油脂含量，如Jako 等［5］發(fā)現(xiàn)在過(guò)量表達(dá)AtDGAT1 基因的野生型擬南芥中油脂積累量增加，Zheng 等［6］發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)DGAT1 基因玉米可以明顯提高玉米種子含油量、胚含油量和油酸含量。紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt］為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，藥食兩用，其油脂含量高達(dá)35%-64%［7］，并且主要以TAG 形式存在［8］，另外在NCBI 網(wǎng)站中也公布了紫蘇基因組中DGAT1基因cDNA 的相關(guān)信息，所以利用RT-PCR 方法克隆紫蘇DGAT1 基因是完全可行的。

四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）屬于綠藻門柵藻科，細(xì)胞呈紡錘形或長(zhǎng)筒形，藻體一般為2、4 或8 個(gè)細(xì)胞組成的單列群體，繁殖迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，是國(guó)內(nèi)外廣泛分布的一種淡水藻類［9］。據(jù)已有報(bào)道四尾柵藻的含油量不高［10］，因此很少選擇其作為制備生物柴油的原料，但由于其具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和生長(zhǎng)速度迅速等優(yōu)點(diǎn)，如果能將其進(jìn)行品種改良提高含油量，就可以將改良后的四尾柵藻作為原料制備生物柴油，并有望解決微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用基因工程技術(shù)在分子水平上對(duì)微藻進(jìn)行品種改良均得到了較好的效果，Manuell 等［11］將牛乳腺免疫血清蛋白的編碼區(qū)（M-SAA）與衣藻葉綠體psbA 基因編碼區(qū)直接替換實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的表達(dá)，所得蛋白總量達(dá)5%以上。郭鎖蓮等［12］利用電擊法將酵母絮凝基因FI07 導(dǎo)入天然非絮凝斜生柵藻中，獲得了具有絮凝性狀的轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞。Pasquale 等［13］以帶有CaMV35S 啟動(dòng)子的pGEM 7zF 為載體將編碼真菌漆酶的poxA1b 基因成功導(dǎo)入到衣藻、針形纖維藻和小球藻中，與野生型相比其異源漆酶的酶活性顯著增加。王長(zhǎng)海等［14］以pBI121 質(zhì)粒為載體成功將外源植酸酶基因?qū)氲胶Ｋ∏蛟逯校D(zhuǎn)化后微藻的植酸酶活性比未轉(zhuǎn)化對(duì)照樣品平均值高4 倍。在國(guó)內(nèi)外研究中，關(guān)于紫蘇DGAT1 基因克隆及利用植物表達(dá)載體pBI121 構(gòu)建四尾柵藻表達(dá)載體的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究將紫蘇DGAT1 基因cDNA 片段與植物表達(dá)載體pBI121 質(zhì)粒進(jìn)行重新拼接，在四尾柵藻中表達(dá)DGAT1 基因以改善四尾柵藻油脂含量低的缺點(diǎn)，旨在為利用基因工程方法改良四尾柵藻品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)實(shí)現(xiàn)生物柴油產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫蘇種子由黑龍江省科學(xué)院大慶分院林甸基地提供。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 Escherichia coli DH5α，菌種編號(hào)81023-1 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；植物表達(dá)載體pBI121 購(gòu)自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司；四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda），藻種編號(hào)FACHB-1476 購(gòu)自中科院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI 網(wǎng)站中紫蘇DGAT1 基因的cDNA 序列（GenBank 登錄號(hào)：AF2-98815.1）利用軟件DNAMAN 設(shè)計(jì)PCR 引物，并在引物兩端分別加入Xba I 和BamH I 限制性酶切位點(diǎn)，由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。引物序列如下：DGAT1-F：5'-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3'；DGAT1-R：5'-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-3'。

1.1.4 主要試劑 Taq 聚合酶，Wide Range DNA Marker，購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司；Trizol，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，SanPrep 柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNAiso Plus，T4 DNA連接酶，SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0，pMD19-T Vector Cloning Kit，限制性內(nèi)切酶Xba I 和BamH I，DNAiso Reagent，瓊脂糖購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇總RNA 的提取方法 用75%乙醇浸泡10 min，再用0.1% DEPC 處理水清洗3 次，最后用無(wú)菌濾紙吸干殘余水分，稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紫蘇種子100 mg 放入已滅菌研缽中，同時(shí)加入液氮充分研磨，再加入6 mL RNAiso Plus 提取液按照試劑盒說(shuō)明書所述步驟提取紫蘇總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)取OD260/OD280比值和1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA 的純度及完整性。

1.2.2 紫蘇DGAT1 基因克隆及克隆載體pMDDGAT1 的構(gòu)建 以紫蘇種子提取的RNA 為對(duì)象，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒所述步驟合成cDNA 第一鏈，再以此cDNA 為模板，以DGAT1-F 和DGAT1-R 為引物對(duì)紫蘇DGAT1基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 75 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止。將PCR 產(chǎn)物用1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)PCR 產(chǎn)物切膠回收，得到目的基因DGAT1。將DGAT1 基因連接到pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于LB/Amp/XGal/IPTG 平板培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，通過(guò)菌落PCR 鑒定。最后，將鑒定的陽(yáng)性克隆送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast 比對(duì)分析。

1.2.3 表達(dá)載體pBI121-DGAT1 的構(gòu)建 將克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體分別用Xba I和BamH I 進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件如下：克隆載體pMD-DGAT1 或pBI121 空載體30 μL，限制酶Xba I 和BamH I 各1 μL，10×共用酶切緩沖液10 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)足至50 μL，37℃水浴鍋中酶切2 h。再將雙酶切后的產(chǎn)物用1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測(cè)，切割目的基因DGAT1 片段和開(kāi)環(huán)的載體片段所在凝膠，并按照DNA 膠回收試劑盒所述步驟分別回收后進(jìn)行連接。反應(yīng)條件如下：目的基因DGAT1 片段5 μL，開(kāi)環(huán)的載體片段3 μL，buffer 1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，16℃連接過(guò)夜。將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h 后挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)。最后將所得轉(zhuǎn)化菌體按照SanPrep 柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒所述步驟提取重組載體pBI121-DGAT1 并用Xba I 和BamH I 進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.4 表達(dá)載體pBI121-DGAT1 轉(zhuǎn)化四尾柵藻情況的檢測(cè) 利用電轉(zhuǎn)化方法［15］將構(gòu)建好的表達(dá)載體pBI121-DGAT1 導(dǎo)入四尾柵藻中，涂布于含卡那霉素抗性的BG11 固體培養(yǎng)基并放置于人工氣候箱中觀察其生長(zhǎng)情況。如有四尾柵藻藻落生長(zhǎng)，分別挑取數(shù)個(gè)單藻落接種至BG11 液體培養(yǎng)基中光照搖床培養(yǎng)，編號(hào)備用。收集轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻藻體，按照DNAiso Reagent 說(shuō)明書所述步驟提取基因組DNA，再以其為模板，以DGAT1-F 和DGAT1-R 為引物，按1.2.2 所述的擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。以未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻作對(duì)照，將四尾柵藻藻體冷凍干燥，準(zhǔn)確稱取10 g 干藻粉利用索氏抽提法［16］進(jìn)行油脂提取。通過(guò)比較轉(zhuǎn)化后和未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻油脂含量，確定目的基因是否表達(dá)，以驗(yàn)證四尾柵藻表達(dá)載體pBI121-DGAT1 的構(gòu)建是否具有應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇總RNA的提取

從紫蘇種子中提取總RNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值在1.8-2.0 之間，表明總RNA 幾乎無(wú)降解。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，28S、18S rRNA 條帶清晰明亮，濃度比約為2∶1，同時(shí)5S rRNA 條帶較微弱，表明提取的紫蘇總RNA 質(zhì)量和純度均符合下一步逆轉(zhuǎn)錄的試驗(yàn)要求。

圖1 紫蘇總RNA 電泳檢測(cè)

2.2 紫蘇DGAT1基因克隆及載體pMD-DGAT1構(gòu)建

以紫蘇RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖2-A）顯示，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 600 bp，與預(yù)期大小一致。回收純化該片段，構(gòu)建克隆載體pMDDGAT1，菌落PCR 結(jié)果（圖2-B）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 600 bp，測(cè)序顯示此片段長(zhǎng)度為1 657 bp。通過(guò)Blast 比對(duì)結(jié)果顯示此片段與GenBank 中紫蘇DGAT1 基因序列的最大同源性為97%，說(shuō)明克隆得到紫蘇DGAT1 基因完整的編碼區(qū)序列，表明紫蘇DGAT1 基因克隆及載體pMD-DGAT1 構(gòu)建成功。

圖2 RT-PCR（A）及菌落PCR（B）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.3 表達(dá)載體pBI121-DGAT1的構(gòu)建

對(duì)克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體進(jìn)行Xba I 和BamH I 雙酶切，分別回收長(zhǎng)度約為1 600 bp 和14 700 bp 的DGAT1 基因和pBI121 空載體片段，連接后所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化菌落中提取得到重組載體，命名為pBI121-DGAT1。將重組載體進(jìn)行Xba I 和BamH I 雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果（圖3）顯示，經(jīng)雙酶切得到兩條片段長(zhǎng)度分別為1 657 bp 和14 729 bp，與連接前長(zhǎng)度一致，表明表達(dá)載體pBI121-DGAT1 構(gòu)建成功。

圖3 重組載體pBI121-DGAT1 雙酶切驗(yàn)證

2.4 表達(dá)載體pBI121-DGAT1轉(zhuǎn)化四尾柵藻的檢測(cè)

利用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體pBI121-DGAT1 導(dǎo)入四尾柵藻中，涂布于含有卡那霉素抗性的BG11固體培養(yǎng)基中可觀察到有四尾柵藻生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻涂布于含有卡那霉素抗性的BG11 固體培養(yǎng)基中未見(jiàn)生長(zhǎng)。以轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果（圖4）顯示，4個(gè)轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻樣品均擴(kuò)增出大小為1 657 bp的片段，與基因DGAT1 長(zhǎng)度一致，表明載體pBI121-DGAT1 已成功轉(zhuǎn)化四尾柵藻。另外，利用索氏抽提法分別測(cè)定未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后四尾柵藻的油脂含量，結(jié)果（圖5）顯示，未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后四尾柵藻的油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的6.3%和11.8%，轉(zhuǎn)化后四尾柵藻的油脂含量較轉(zhuǎn)化前提高近1 倍，說(shuō)明DGAT1 基因已經(jīng)在四尾柵藻中成功表達(dá)。

3 討論

圖4 表達(dá)載體pBI121-DGAT1 轉(zhuǎn)化四尾柵藻PCR 驗(yàn)證

圖5 未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻油脂含量對(duì)比圖

近年來(lái)，生物柴油作為一種新型環(huán)?？稍偕茉闯蔀榱藝?guó)內(nèi)外廣泛研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前制備生物柴油的主要原料是油料作物，但由于其具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低和占用耕地等缺點(diǎn)制約了生物柴油的進(jìn)一步發(fā)展。微藻因其具有生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是一種高潛力的生物柴油新型原料［17］，但微藻油脂存在單位光照面積產(chǎn)量低和生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，因此如何能有效地提高微藻體內(nèi)油脂含量成為新一輪的研究熱點(diǎn)。微藻油脂合成代謝途徑是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，涉及到多種酶的協(xié)同作用和質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的參與，同時(shí)與糖類和蛋白質(zhì)代謝也有著密切的關(guān)系［18］，所以微藻產(chǎn)油量的提高可以從生化途徑和基因工程途徑兩方面入手。生化途徑是一種通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)條件將光合作用產(chǎn)生的代謝流更多地導(dǎo)向脂類的生物合成途徑，但由于營(yíng)養(yǎng)物限制或生理逆境作用而抑制細(xì)胞分裂導(dǎo)致生物量下降，因此利用其提高微藻產(chǎn)油量存在很大的局限性?；蚬こ掏緩绞侵冈隗w外將外源基因插入病毒、質(zhì)粒等載體中構(gòu)建重組DNA 分子，然后將重組DNA 分子導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子操作途徑，與生化途徑相比利用基因工程途徑可以從根本上提高微藻的產(chǎn)油量。因此本研究以紫蘇RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄克隆得到DGAT1 基因，并將其與植物表達(dá)載體pBI121 進(jìn)行重組構(gòu)建成以CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的四尾柵藻表達(dá)載體，最后利用電轉(zhuǎn)化方法獲得了轉(zhuǎn)基因四尾柵藻。植物表達(dá)載體pBI121 本身就帶有強(qiáng)大的CaMV35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因，實(shí)現(xiàn)了基因的表達(dá)以及轉(zhuǎn)化子的有效篩選。篩選后獲得的四尾柵藻油脂含量與未轉(zhuǎn)化的野生型相比提高了近1 倍，說(shuō)明DGAT1 基因通過(guò)基因工程途徑提高四尾柵藻產(chǎn)油量達(dá)到了一定的效果，但是轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻油脂含量為11.8%，與油脂含量較高的微藻（如硅藻［19］）相比差距還是很大，所以在今后的研究中可嘗試將多個(gè)DGAT1 基因并列連接到一個(gè)表達(dá)載體中，構(gòu)建DGAT1 超表達(dá)載體，以期實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因四尾柵藻產(chǎn)油量的大幅度提高。本研究成功構(gòu)建DGAT1 四尾柵藻表達(dá)載體，并達(dá)到了提高四尾柵藻油脂含量的應(yīng)用效果，為開(kāi)發(fā)高產(chǎn)油微藻新品種提供新方向，也為實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供充分的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

以紫蘇總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴(kuò)增出DGAT1 基因的cDNA 編碼區(qū)序列并構(gòu)建克隆載體pMD-DGAT1，經(jīng)測(cè)定克隆所得DGAT1 基因片段長(zhǎng)度為1 657 bp，與GenBank 中紫蘇DGAT1 基因序列的最大同源性為97%。Xba I/BamH I 雙酶切克隆載體pMD-DGAT1 和pBI121 空載體，連接目的片段成功構(gòu)建四尾柵藻表達(dá)載體pBI121-DGAT1，電轉(zhuǎn)化后四尾柵藻的油脂含量較轉(zhuǎn)化前提高近1 倍。

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