朱小慧 盛德喬 康樂(lè) 伍仙鳳 邵文 劉曉艷

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002）

DEAF1（Deformed epidermal autoregulatory factor-1）最早是從果蠅的核抽提物中純化得到的，也是果蠅早期胚胎發(fā)育所必須的一種序列特異的DNA 結(jié)合蛋白，能特異地與變形效應(yīng)元件結(jié)合。與其它的轉(zhuǎn)錄因子一樣，DEAF1 也有幾個(gè)非常重要的功能結(jié)構(gòu)域——氨基端的丙氨酸富含區(qū)，SAND（Sp100、AIRE-1、NucP41/75 及DEAF-1）結(jié)構(gòu)域，螺旋-環(huán)-螺旋基元，MYND（myeloid、Nervy 及Deaf-1）結(jié)構(gòu)域，核定位序列（Nuclear-localization sequence，NLS）和出核序列（Nuclear-export sequence，NES）［1］。SAND 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域；MYND 結(jié)構(gòu)域則含有兩個(gè)非DNA 結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)，它被認(rèn)為可介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用［2］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子DEAF1 在小鼠胰淋巴結(jié)中調(diào)控著一系列外周組織抗原（peripheral tissue antigen，PTA）基因的表達(dá)，而且，DEAF1 的功能異常與NOD 小鼠1 型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)［3，4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，DEAF1 在淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)控真核翻譯起始因子Eif4g3 的表達(dá)而在翻譯水平上調(diào)控很多PTA 基因的表達(dá)［5］。PTA 基因在淋巴結(jié)中的異位表達(dá)并有效提呈是外周免疫耐受建立的重要機(jī)制之一［6］，DEAF1 可能在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

本研究擬利用多克隆抗體制備技術(shù)來(lái)制備小鼠DEAF1 的多克隆抗體，旨在為研究小鼠淋巴結(jié)中內(nèi)源性DEAF1 的表達(dá)及DEAF1 調(diào)控外周組織抗原表達(dá)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

帶有小鼠DEAF1 cDNA 的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-mDF1 和真核表達(dá)質(zhì)粒p3xflag-CMV-10-mDF1 由本課題組構(gòu)建；Monoclonal ANTI-FLAG M2購(gòu)自Sigma 公司；His-Tag（2A8）Mouse mAb 購(gòu)于上海Abmart 公司；羊抗鼠IgG（H+L）-HRP 購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司；293T 細(xì)胞株和Caski 細(xì)胞株由三峽大學(xué)分子生物研究所保存；BalB/C 小鼠購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 原核蛋白的表達(dá)與純化 將小鼠DEAF1 的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-mDF1 轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株E.coli BL21；挑取單克隆，37℃恒溫培養(yǎng)12-16 h；按1∶50 比例轉(zhuǎn)接上一步得到的菌懸液至50 mL LB（Kan+）培養(yǎng)液中；37℃，220 r/min 培養(yǎng)2-3 h（菌液OD=0.4-0.6）即對(duì)數(shù)期時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為1 mmol/L）；37℃，220 r/min 培養(yǎng)10-12 h。

4℃，5 000 r/min 離心10 min 收菌；棄上清，10 mL 1×PBS 重懸沉淀；冰浴超聲（功率400 W，超聲2 s，間隔2 s，工作60 次，循環(huán)6 次）；12 000 r/min，4℃離心20 min；上清制樣，沉淀用于尿素梯度裂解。

1 mol/L Urea 5 mL 重懸沉淀，冰置裂解30 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣，沉淀用2 mol/L Urea 5 mL 重懸，冰置裂解20 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣，沉淀用3 mol/L Urea 5 mL 重懸，冰置裂解30 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣，沉淀用4 mol/L Urea 5 mL 重懸，冰置裂解10 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣，沉淀用5 mol/L Urea 2 mL 重懸，冰置裂解5 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣后余下的-20℃保存，沉淀用6 mol/L Urea 1 mL 重懸，冰置裂解5 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣后余下的-20℃保存，沉淀用7 mol/L Urea 1 mL重懸，冰置裂解5 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；上清制樣后余下的-20℃保存，沉淀用8 mol/L Urea 1 mL 重懸；冰置裂解2 h，裂解產(chǎn)物制樣后-20℃保存。

將尿素梯度裂解純度較高的蛋白進(jìn)行透析，逐步去除尿素；用Millipore 公司提供的50 mL 超濾管濃縮；最后利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀以BSA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線做參照，測(cè)定蛋白的濃度；所得蛋白-40℃保存。純化的蛋白用SDS-PAGE 檢測(cè)和Western blot 鑒定。

1.2.2 動(dòng)物免疫及多克隆抗血清的制備 以純化獲得的小鼠DEAF1 重組蛋白為抗原與完全弗氏佐劑等體積混合；冰浴超聲乳化后，皮下多點(diǎn)注射4-6 周齡的Balb/C 小鼠4 只，每只小鼠50 μg 抗原蛋白。4周后，進(jìn)行第2 次免疫：等體積混合抗原溶液與不完全弗氏佐劑；冰浴超聲乳化后，皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠25 μg 抗原蛋白。2 周后，進(jìn)行第3 次免疫，操作與第2 次免疫相同。1 周后，免疫小鼠斷尾取血，通過(guò)間接ELISA 法檢測(cè)其血清的效價(jià)。之后，眼球取血效價(jià)達(dá)標(biāo)的Balb/C 小鼠，以獲得多克隆抗血清。

1.2.3 鼠抗DEAF1 多克隆抗血清用于Western blot檢測(cè)真核細(xì)胞表達(dá)的DEAF1 蛋白 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠DEAF1 的真核表達(dá)質(zhì)粒p3xflag-CMV-10-mDF1 至人腎上皮細(xì)胞系293T 中；48 h 后裂解細(xì)胞收取總蛋白制樣。SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉2 h；分別加入鼠抗DEAF1 多克隆抗血清（5%牛奶進(jìn)行1∶5 000 稀釋?zhuān)?，?Actin 鼠源單抗（利用5%牛奶進(jìn)行1∶3 000 稀釋?zhuān)┖虵lag-Tag 單抗（利用5%牛奶進(jìn)行1∶2 000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；加入TBST洗滌3 次（10 min/次）；加入羊抗鼠IgG-HRP（利用TBST 進(jìn)行1∶5 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h；加入TBST 洗滌3 次（10 min/次）；ECL 顯影。

1.2.4 鼠抗DEAF1 多克隆抗血清用于免疫熒光 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p3xflag-CMV-10-DF1 至人的宮頸癌細(xì)胞株Caski 中；24 h 后 重 新 鋪24 孔 板；5% CO2培 養(yǎng) 箱37℃恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞處于最佳狀態(tài)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1×PBS 漂洗3 次（5 min/次）；4%多聚甲醛（500 μL/孔）固定15 min；1×PBS 漂洗3 次（5 min/次）；0.5% Triton X-100（500 μL/孔）處理20 min；1×PBS 漂洗3 次（5 min/次）；10%的山羊血清（500 μL/孔）37℃封閉20 min；吸去封閉液，加入制備的鼠抗DEAF1 多克隆抗血清（1×PBS 進(jìn)行1∶500 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜（以1×PBS 作為空白對(duì)照，未經(jīng)免疫的Balb/C 小鼠的血清作為陰性對(duì)照）；1×PBS漂洗3 次（5 min/次）。37℃避光加入熒光標(biāo)記的二抗羊抗鼠Rhodamine（200 μL/孔）（1×PBS 進(jìn)行1∶150 稀釋?zhuān)┓跤?0 min；1×PBS 漂洗3 次（5 min/次）；熒光倒置顯微鏡觀察分析，拍片記錄結(jié)果。

1.2.5 DEAF1 多克隆抗血清用于免疫沉淀 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠p3xFlag-CMV-10-mDF1 至人的宮頸癌細(xì)胞株Caski 中；轉(zhuǎn)染48 h 后，胰酶消化收集細(xì)胞；加入Western blot 裂解液冰浴裂解獲得總蛋白；分組后，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。

取80 μL protein A 瓊脂糖珠儲(chǔ)存液；離心后棄上清，加入Western blot 裂解液洗滌沉淀3 次；加入80 μL Western blot 裂解液重懸沉淀；將重懸后的protein A 瓊脂糖珠加到蛋白樣品中（20 μL/份），4℃孵育4 h；離心棄上清后，加入Western blot 洗滌沉淀4 次；離心棄上清，沉淀制樣；Western blot 檢測(cè)免疫沉淀的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 尿素梯度裂解包涵體純化重組蛋白DEAF1

大量誘導(dǎo)重組蛋白DEAF1 在E.coli BL 21 中表達(dá)10 h（圖1）；收菌后超聲破碎細(xì)胞；離心后的沉淀逐級(jí)裂解；各級(jí)裂解的產(chǎn)物制樣后經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定濃度和純度，結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)尿素梯度裂解，8 mol/L Urea 裂解的產(chǎn)物中，重組蛋白DEAF1 的相對(duì)含量最高。

2.2 Western blot鑒定重組蛋白的表達(dá)與純化

上樣誘導(dǎo)前后以及尿素梯度裂解包涵體7 mol/L尿素裂解的產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；轉(zhuǎn)膜后于5%牛奶中室溫封閉2 h；加入6×His 鼠源單抗（5%牛奶進(jìn)行1∶5 000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3次（10 min/次）；加入羊抗鼠IgG-HRP（TBST 進(jìn)行1∶3 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h；TBST 洗滌3 次（10 min/次）；暗室內(nèi)ECL 顯影，結(jié)果（圖3）顯示，誘導(dǎo)純化獲得的蛋白為重組的DEAF1 蛋白。

2.3 鼠抗DEAF1多克隆抗血清的測(cè)定

以純化獲得的小鼠DEAF1 重組蛋白包被96 孔酶標(biāo)板（100 μL/孔）通過(guò)ELISA 法測(cè)定小鼠血清的效價(jià)。結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)過(guò)3 次免疫，4 只小鼠血清的效價(jià)均達(dá)到了較高的水平，以2 號(hào)小鼠血清的效價(jià)為最高，故將其用于后面的試驗(yàn)中。

2.4 DEAF1多克隆抗血清用于Western blot檢測(cè)真

核表達(dá)的DEAF1蛋白

依據(jù)1.2.2 所述的方法將所制備的DEAF1 多克隆抗血清用于Western blot 檢測(cè)293T 細(xì)胞中DEAF1的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5）顯示，所制備的鼠抗DEAF1 多克隆抗血清可有效結(jié)合真核表達(dá)的DEAF1蛋白，具有較高的特異性。

圖5 Western blot 檢測(cè)制備的鼠抗DEAF1 多克隆抗血清對(duì)于真核表達(dá)的DEAF1 蛋白的特異性和敏感性

2.5 DEAF1多克隆抗血清用于免疫熒光分析

將所制備的DEAF1 多克隆抗血清用于分析DEAF1 在Caski 細(xì)胞中的定位，結(jié)果（圖6）顯示，DEAF1 蛋白主要定位于細(xì)胞核中，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，表明所制備的DEAF1 多克隆抗血清具備較高的敏感性。

圖6 制備鼠抗DEAF1 多克隆抗體用于免疫熒光法分析人宮頸癌細(xì)胞株Caski 中DEAF1 蛋白的表達(dá)（1∶500）（400×）

2.6 DEAF1多克隆抗血清用于免疫沉淀試驗(yàn)

除了特異性和敏感性，親和力也是衡量抗體質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。為此，本研究將所制備鼠抗DEAF1 多克隆抗血清用于免疫沉淀試驗(yàn)。結(jié)果（圖7）顯示，該鼠抗DEAF1 多克隆抗血清的親和力足夠沉淀Caski 細(xì)胞中所表達(dá)的DEAF1 蛋白。

圖7 制備鼠抗DEAF1 多克隆抗血清通過(guò)免疫沉淀試驗(yàn)檢測(cè) Caski，Caski/DEAF1 中的DEAF1 蛋白

3 討論

最新研究發(fā)現(xiàn)，DEAF1 不僅可以直接控制幾百種基因的轉(zhuǎn)錄，而且可以通過(guò)控制真核翻譯起始因子Eif4g3 的表達(dá)間接控制多種基因的翻譯，其功能異常與T1DM 的發(fā)生密切相關(guān)［3-5］。

已有的關(guān)于DEAF1 表達(dá)變化的研究只是轉(zhuǎn)錄水平，其蛋白水平的變化還不清楚。目前商品化的抗體特異性和敏感性都不是很好，故本研究擬制備合適的DEAF1 抗體，為研究小鼠胰淋巴結(jié)中內(nèi)源性DEAF1 的表達(dá)及DEAF1 調(diào)控外周組織抗原表達(dá)的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

本研究將小鼠DEAF1 的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-mDF1 轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli BL21 后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)可高效表達(dá)出DEAF1 重組蛋白；但重組DEAF1蛋白以包涵體形式存在，所以采用了尿素梯度裂解包涵體的方法來(lái)純化重組DEAF1 蛋白；以此重組蛋白為抗原與弗氏佐劑等體積混合后，皮下多點(diǎn)注射Balb/C 小鼠，最終成功制備出鼠抗DEAF1 的多克隆抗血清，經(jīng)Western blot、免疫熒光、免疫沉淀分析鑒定，該鼠抗DEAF1 的多克隆抗血清具有較高的特異性、敏感度和親和力，可為進(jìn)一步開(kāi)展DEAF1 的蛋白水平研究奠定基礎(chǔ)。

另外，本研究所采用的尿素梯度裂解包涵體純化蛋白的方法是在參照文獻(xiàn)［8］的基礎(chǔ)上，依據(jù)本試驗(yàn)的條件，自行摸索出來(lái)的方法。與其他蛋白純化的方法相比［9-14］，該方法不僅操作簡(jiǎn)單耗時(shí)短而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，所用的藥品試劑方便易取，目的蛋白的回收率也比較高。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用分子克隆和原核表達(dá)技術(shù)獲得了原核表達(dá)的DEAF1 蛋白，利用改良的尿素梯度裂解法從包涵體中純化得到了重組DEAF1 蛋白，以此重組蛋白免疫小鼠，制備鼠抗DEAF1 多克隆抗血清。ELISA、Western blot、免疫熒光、和免疫沉淀的結(jié)果表明，該多克隆抗血清具有良好的特異性、敏感性和親和力，可用于內(nèi)源性DEAF1 的表達(dá)及熒光定位分析。

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