董穎 胡紅霞 王巍 田照輝

（北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國(guó)家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

轉(zhuǎn)座子（transposon）是基因組上的一段具有一定長(zhǎng)度的DNA 序列，其在自身編碼的轉(zhuǎn)座酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以“剪切/復(fù)制-粘貼”的方式在基因組中進(jìn)行移動(dòng)［1］。自1951 年McClintock［2］首次在玉米中發(fā)現(xiàn)AC/Ds（Activator/Dissociator）轉(zhuǎn)座子以來(lái)，在細(xì)菌及多種真核生物中均發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子的存在［3-6］。但是長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)脊椎動(dòng)物中轉(zhuǎn)座子的研究和應(yīng)用都還是空白。直到近十幾年才有青鳉Tol1 和Tol2［7，8］、鮭魚(yú)SB［9］以及金魚(yú)Tgf2［10］等幾例魚(yú)類(lèi)活性轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。

青鳉Tol2 轉(zhuǎn)座子（Transposable element of Oryzias latipes，number 2）是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一例天然具有活性的轉(zhuǎn)座子。Tol2 轉(zhuǎn)座子屬于hAT 超轉(zhuǎn)座子家族，其自身包含編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，能以“剪切-粘貼”的方式進(jìn)行自主轉(zhuǎn)座。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，Tol2轉(zhuǎn)座子已被成功應(yīng)用于果蠅［11］、斑馬魚(yú)［12］、非洲爪蟾［13］和小鼠［14］等模式生物的轉(zhuǎn)基因研究中，證明其具有一定的通用性。但是，Tol2 轉(zhuǎn)座子在金魚(yú)中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用PCR 的方法以質(zhì)粒pCAgcGH 為模板擴(kuò)增出一段含有草魚(yú)生長(zhǎng)激素（GH）5 個(gè)外顯子、鯉魚(yú)beta-actin 啟動(dòng)子及多個(gè)酶切位點(diǎn)的序列，并將這段序列與質(zhì)粒pTol2-MCSEGFP 進(jìn)行重組，得到重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP。采用顯微注射的方法將重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 與體外合成的Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA 一起注入草金魚(yú)受精卵中，獲得表達(dá)GH 基因和綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)。利用Tol2 轉(zhuǎn)座子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用草金魚(yú)（Carassius auratus）購(gòu)買(mǎi)自北京市通州區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站。

1.1.2 主要試劑與試劑盒 內(nèi)切酶BamH I、Xho I和Not I 購(gòu)自NEB 公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司。膠回收試劑盒和基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自Axygen 公司。mRNA 體外合成試劑盒（mMESSAGE mMACHINE? SP6 Kit）購(gòu)自Invitrogen 公司。10×Holf’s 儲(chǔ) 存 液：將1 g CaCl、20.5 g KCl 和3.5 g NaCl 加蒸餾水至1 L，煮沸儲(chǔ)存。用時(shí)將10×儲(chǔ)存液稀釋至1×工作液，用氣泵曝氣過(guò)夜，并加入終濃度為10 萬(wàn)單位/L 的青霉素和5 萬(wàn)單位/L 的鏈霉素。使用1×Holf’s 工作液配置50 μg/mL 的胰酶溶液。

1.1.3 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP、pCSTol2由北京大學(xué)趙玨老師贈(zèng)送；質(zhì)粒pCAgcGH 由中科院水生生物研究所胡煒研究員提供。

1.1.4 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)為Bio-RAD 公司Gel Doc 2000 型產(chǎn)品，顯微注射儀為ASI 公司MPPI3型產(chǎn)品，熒光顯微成像系統(tǒng)為OLYMPUS 公司DP72型產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 質(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP 含有綠色熒光蛋白基因GFP、Tol2 轉(zhuǎn)座子和多個(gè)酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pCAgcGH 含有草魚(yú)生長(zhǎng)激素基因（GH）的5 個(gè)外顯子、鯉魚(yú)beta-actin 啟動(dòng)子及多個(gè)酶切位點(diǎn)。因?yàn)橘|(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP（保留GFP 和Tol2 轉(zhuǎn)座子序列）和質(zhì)粒pCAgcGH（保留GH 的5 個(gè)外顯子和鯉魚(yú)beta-actin 啟動(dòng)子）待保留區(qū)域之間只有一個(gè)共同的酶切位點(diǎn)BamH I，所以針對(duì)質(zhì)粒pCAgcGH 序列設(shè)計(jì)PCR 引物，從BamH I 酶切位點(diǎn)開(kāi)始，跨GH的5 個(gè)外顯子，并加酶切位點(diǎn)Xho I 的接頭，引物序列為T(mén)GATGAAAATCGCTTAGGGA 和CCGCTCGAGAGGCTTTACACTTTATGCTT。使用上述引物對(duì)質(zhì)粒pCAgcGH 進(jìn)行擴(kuò)增，使用膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。再對(duì)回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行BamH I/Xho I 雙酶切。純化后與同樣經(jīng)雙酶切處理的質(zhì)粒pTol2-MCSEGFP 過(guò)夜連接，獲得重組質(zhì)粒，命名為pTol2-GHEGFP。根據(jù)質(zhì)粒pCAgcGH 保留區(qū)序列及插入方向，設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，序列為CGCAACCCTCAGGTAAGT 和TCTTCAACAACGCAGTCA。將重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB 平板培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，選取氨芐陽(yáng)性的單克隆接入LB 液體培養(yǎng)基，并使用檢測(cè)引物對(duì)菌液進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，使用質(zhì)粒提取試劑盒從可以成功擴(kuò)增檢測(cè)引物的菌株中提取質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 轉(zhuǎn)座子mRNA 的合成 使用Not I 內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pCSTol2 進(jìn)行酶切，使其線性化，用SP6 RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)的獲得及驗(yàn)證 選取自然性成熟的雌雄草金魚(yú)，采用人工干法授精的方式獲得受精卵。將受精卵置于1×Holf’s 工作液，受精后約2-3 min 開(kāi)始舉膜，待舉膜比較完全后將Holf’s 工作液替換為胰酶溶液溶解卵膜，待卵脫膜以后用Holf’s 工作液清洗幾次，將其轉(zhuǎn)移到提前鋪好瓊脂糖并加有Holf’s 工作液的表面皿里。將質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 與體外合成的Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA 按終濃度100 ng/μL 和70 ng/μL 進(jìn)行混合，在受精卵第一次卵裂前，通過(guò)顯微注射的方法注射入動(dòng)物極。之后將卵轉(zhuǎn)移到18℃的1×Holf’s 工作液中培養(yǎng)，魚(yú)苗孵出后，在熒光顯微鏡下挑選發(fā)出綠色熒光的個(gè)體，獲得轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)。孵化2 周后，取幾尾能發(fā)出綠色熒光的魚(yú)苗，使用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，并以此為模板使用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR，檢驗(yàn)其中是否含有轉(zhuǎn)入的外源基因。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)PCR 引物擴(kuò)增出質(zhì)粒pCAgcGH 的一段序列，同時(shí)引入Xho I 酶切位點(diǎn)，得到4 330 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥詹⒓兓疨CR 產(chǎn)物，再進(jìn)行BamH I/Xho I 雙酶切，之后與經(jīng)同樣雙酶切處理的質(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP 進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pTol2-GHEGFP。雙酶切電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)粒pCAgcGH 擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP的雙酶切鑒定

2.2 載體驗(yàn)證及陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因魚(yú)檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐陽(yáng)性的菌落，使用本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的草魚(yú)GH 檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 580 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，證明重組質(zhì)粒中包含有GH 基因，結(jié)果見(jiàn)圖2 泳道1-5。設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP（圖3）進(jìn)行測(cè)序，確保其中即含有Tol2 轉(zhuǎn)座子和綠色熒光蛋白（GFP）基因，又含有草魚(yú)生長(zhǎng)激素（GH）基因的5 個(gè)外顯子。取3 尾能發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)基因魚(yú)提取基因組DNA，以此為模板使用同樣的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR，得到長(zhǎng)度為1 580 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，證明其中均含有轉(zhuǎn)入的外源基因，結(jié)果見(jiàn)圖2 泳道6-8。

2.3 轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)的獲得及驗(yàn)證

在紫外光下，最早可以于受精后21.5 h 觀察到部分胚胎發(fā)出微弱的綠色熒光。在進(jìn)行了顯微注射的150 粒受精卵中共有133 尾仔魚(yú)成功孵化，其中有26 尾可以在紫外光下觀察到綠色熒光，占總數(shù)的17.3%。圖4 為不同時(shí)期的轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)熒光檢測(cè)結(jié)果。

圖2 重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 菌液及轉(zhuǎn)基因魚(yú)外源基因檢驗(yàn)結(jié)果

圖3 質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 圖譜

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)基因方法的比較

自朱作言等［15］利用顯微注射法首次成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚(yú)模型以來(lái)，顯微注射法就被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究中。除此之外，電脈沖（電穿孔）法［16］和精子載體法［17］也是比較常用的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因方法。另外，還有磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染、微彈轟擊、激光介導(dǎo)和基因槍?zhuān)Ｗ訕專(zhuān)┑榷喾N方法可以將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞［18］。

顯微注射法是目前被使用最多的轉(zhuǎn)基因操作方法，它具有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率較高的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)對(duì)試驗(yàn)者的操作技能要求較高，而且因?yàn)橐诘谝淮温蚜亚巴瓿勺⑸?，所以一批次只能處理比較少的卵，相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而電脈沖法雖然陽(yáng)性率略低［19］，但一次可以處理大量受精卵，且試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力。精子載體法不會(huì)對(duì)卵造成機(jī)械損傷，外源基因?qū)肱c受精過(guò)程同步完成，但是由于精子載體法的作用機(jī)理尚不明確，導(dǎo)入的外源基因可能會(huì)被降解或不能整合到基因組中去，而是更多的以附加體的形式存在［20］，且轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率差異巨大，難以控制。

圖4 胚胎及仔魚(yú)期轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)熒光檢測(cè)結(jié)果

Sumiyama 等［21］首次將攜帶有外源基因的Tol2轉(zhuǎn)座子載體與體外合成的轉(zhuǎn)座酶mRNA 一起注射入小鼠受精卵的細(xì)胞質(zhì)中，該方法可以較大幅度的提高外源基因的整合效率。本研究首次用此方法構(gòu)建金魚(yú)轉(zhuǎn)基因方法，外源基因的表達(dá)率為17.3%，與Sumiyama 等［21］的20%陽(yáng)性檢出率差異不大，都顯著高于常規(guī)顯微注射轉(zhuǎn)基因方法2%-5%的陽(yáng)性檢出率。

3.2 青鳉Tol2轉(zhuǎn)座子的研究和應(yīng)用

Tol2 轉(zhuǎn)座子是日本學(xué)者在對(duì)正常日本青鳉（Oryzias latipes）與其白化變種的酪氨酸酶基因進(jìn)行比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的［8］，它是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一例天然具有活性的轉(zhuǎn)座子。Tol2 轉(zhuǎn)座子屬于hAT 轉(zhuǎn)座子超家族，這個(gè)轉(zhuǎn)座子超家族還包括玉米的Ac 轉(zhuǎn)座子［22］、果蠅的hobo 轉(zhuǎn)座子［23］、金魚(yú)草的Tam3轉(zhuǎn)座子［24］和金魚(yú)的Tgf2 轉(zhuǎn)座子［10］。Tol2 轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)4 681 bp，其自身包含一個(gè)由4 個(gè)外顯子構(gòu)成的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，它能翻譯成一個(gè)含有649 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，并催化Tol2 轉(zhuǎn)座子以“剪切-粘貼”的方式在基因組中進(jìn)行自主移動(dòng)［8，25］。利用Tol2 轉(zhuǎn)座子開(kāi)展魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究，轉(zhuǎn)基因效率較高，可攜帶大片段外源基因轉(zhuǎn)入，畸形率較低，整合位點(diǎn)便于檢測(cè)，同時(shí)不會(huì)引入質(zhì)粒骨架而干擾魚(yú)類(lèi)正常基因的表達(dá)。

Kawakami 等［26］以綠色熒光蛋白基因GFP 作為報(bào)告基因，通過(guò)顯微注射將帶有Tol2 轉(zhuǎn)座子和GFP基因的質(zhì)粒和人工合成的編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA 一起注入到斑馬魚(yú)受精卵中，使轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定地整合到基因組中，挑選含有外源基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為親本與野生型進(jìn)行雜交，檢測(cè)F1 代發(fā)現(xiàn)有50%-70%為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。上述試驗(yàn)表明外源基因通過(guò)Tol2 轉(zhuǎn)座子整合到宿主基因組上，并可以遺傳到下一代。在對(duì)呂宋青鳉（O. luzonensis）（日本青鳉的近緣種，但是自身不含Tol2 轉(zhuǎn)座子）的類(lèi)似試驗(yàn)中也獲得了相同的結(jié)果［27］。此外，Tol2 轉(zhuǎn)座子也被成功應(yīng)用于果蠅［11］、非洲爪蟾［13］、雞［28］和小鼠［14］等動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因研究中。

利用Tol2 轉(zhuǎn)座子可以構(gòu)建具有組織特異表達(dá)能力的轉(zhuǎn)基因載體，如脊髓特異表達(dá)［29］或心臟組織特異表達(dá)［30］轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)家系的建立就對(duì)研究這兩個(gè)組織的發(fā)育調(diào)控和基因表達(dá)具有重要意義。

Kawakami 等［31］利用Tol2 轉(zhuǎn)座子對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行基因捕獲研究，他們將帶有報(bào)告基因GFP 的重組質(zhì)粒隨機(jī)整合到斑馬魚(yú)基因組中，然后通過(guò)反向PCR 的方法鑒定了捕獲載體插入位點(diǎn)上下游的基因序列，再利用RACE 的方法獲得了8 種報(bào)告基因與內(nèi)源基因的融合轉(zhuǎn)錄本。Parinov 等［32］利用Tol2 轉(zhuǎn)座子進(jìn)行斑馬魚(yú)增強(qiáng)子捕獲，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因?yàn)閳?bào)告基因挑選出37 個(gè)陽(yáng)性魚(yú)苗，并以此為基礎(chǔ)分離出28 個(gè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)家系用以研究斑馬魚(yú)的體內(nèi)發(fā)育調(diào)控。Asakawa 和Kawakami［33］利用上游激活序列（Upstream activating sequence，UAS）的轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4FF 構(gòu)建載體進(jìn)行基因捕獲與增強(qiáng)子捕獲，當(dāng)有內(nèi)源基因被捕獲時(shí)轉(zhuǎn)錄激活因子得以表達(dá)，而將基因捕獲個(gè)體與帶有報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系UAS-GFP 雜交后，轉(zhuǎn)錄激活因子可以刺激報(bào)告基因強(qiáng)烈表達(dá)。

目前，Tol2 轉(zhuǎn)座子已經(jīng)被成功應(yīng)用于包括昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)以及哺乳動(dòng)物等多種動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、基因捕獲以及增強(qiáng)子捕獲等方面的研究中，其中在模式生物斑馬魚(yú)上的研究成果最多。本研究利用Tol2 轉(zhuǎn)座子成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)，擴(kuò)大了Tol2 轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用范圍，并為進(jìn)一步開(kāi)展關(guān)于基因捕獲及其功能等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 Tol2轉(zhuǎn)座子對(duì)金魚(yú)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率的影響

Liu 等［34］利用顯微注射法將含有豬生長(zhǎng)激素基因的線性DNA 片段注入金魚(yú)受精卵，其轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為2%。劉艷紅等［35］采用顯微注射的方法將綠色熒光蛋白（GFP）基因重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入金魚(yú)受精卵中，3 批試驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率分別為4.24%、8.51%和6.77%。胡瑩瑩等［36］利用精子載體法通過(guò)昆蟲(chóng)piggyBac 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)成功獲得轉(zhuǎn)基因金魚(yú)，但是其陽(yáng)性率極低（小于1%）。而本試驗(yàn)通過(guò)顯微注射法將帶有Tol2 轉(zhuǎn)座子和外源基因的質(zhì)粒與體外合成的Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA 一起注入到金魚(yú)受精卵中，獲得轉(zhuǎn)基因金魚(yú)的陽(yáng)性率為17.3%，顯著高于未使用Tol2 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，說(shuō)明Tol2 轉(zhuǎn)座子在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因金魚(yú)的過(guò)程中有助于提高轉(zhuǎn)基因效率。另外，利用新發(fā)現(xiàn)的金魚(yú)Tgf2 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)開(kāi)展金魚(yú)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)獲得的熒光率為83%［37］，這可能是由于金魚(yú)受精卵的細(xì)胞質(zhì)中具有內(nèi)源性的Tgf2 轉(zhuǎn)座酶mRNA，而大量的轉(zhuǎn)座酶mRNA 有助于提高轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率。因此，可嘗試通過(guò)加大Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA 的注射量來(lái)提高其在金魚(yú)中的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率。另外，外源基因的注射濃度以及質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA 的混合比例也將在進(jìn)一步試驗(yàn)中進(jìn)行調(diào)整，以期提高外源基因的表達(dá)陽(yáng)性率。

3.4 青鳉Tol2轉(zhuǎn)座子與金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子的比較

2010 年，鄒曙明等［10］在我國(guó)不同品系金魚(yú)中發(fā)現(xiàn)hAT 家族的一個(gè)新成員，命名為金魚(yú)Tgf2 轉(zhuǎn)座子，它是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第二例具有自主活性的轉(zhuǎn)座子。金魚(yú)Tgf2 轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)4720 bp，由4 個(gè)閱讀框組成，它與青鳉Tol2 轉(zhuǎn)座子的序列相似度為97%，且都含有末端倒位重復(fù)、亞末端重復(fù)和內(nèi)含子中間倒位重復(fù)序列。但是兩者的末端倒位重復(fù)和亞末端重復(fù)序列存在一定差異，而這一區(qū)域恰好與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性密切相關(guān)［38］。另外，金魚(yú)Tol2轉(zhuǎn)座子第一內(nèi)含子的1 453 bp 到2 091 bp 區(qū)域?yàn)榉聪蛑貜?fù)序列，與青鳉Tol2 轉(zhuǎn)座子中間反向重復(fù)序列可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)不同，Tgf2 轉(zhuǎn)座子的中間反向重復(fù)序列可形成“十”字結(jié)構(gòu)，這也可能對(duì)其轉(zhuǎn)座活性產(chǎn)生影響。目前，對(duì)金魚(yú)Tgf2 轉(zhuǎn)座子的研究尚處于起步階段。考慮到Tol2 轉(zhuǎn)座子和Tgf2 轉(zhuǎn)座子的相似性，Tol2 轉(zhuǎn)座子在金魚(yú)中的應(yīng)用將對(duì)研究Tgf2 轉(zhuǎn)座子具有一定的積極作用。同時(shí)，對(duì)二者的比較研究也將有助于了解轉(zhuǎn)座子序列及結(jié)構(gòu)的功能。

4 結(jié)論

本研究采用PCR 的方法以質(zhì)粒pCAgcGH 為模板擴(kuò)增出一段含有草魚(yú)生長(zhǎng)激素（GH）5 個(gè)外顯子、鯉魚(yú)beta-actin 啟動(dòng)子及多個(gè)酶切位點(diǎn)的序列，并將這段序列與質(zhì)粒pTol2-MCS-EGFP 進(jìn)行重組，得到重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP。采用顯微注射的方法將重組質(zhì)粒pTol2-GH-EGFP 與體外合成的Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA 一起注入草金魚(yú)受精卵中，獲得表達(dá)GH基因和綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因草金魚(yú)，表達(dá)率為17.3%。

致謝：

感謝中科院水生生物研究所胡煒研究員提供草魚(yú)GH 質(zhì)粒；感謝北京大學(xué)朱作言院士實(shí)驗(yàn)室趙玨博士提供的Tol2 轉(zhuǎn)座子及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給與的幫助。

［1］ Curcio MJ, Derbyshire KM. The outs and ins of transposition：from mu to kangaroo［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2003, 4（11）：865-877.

［2］ McClintock B. Chromosome organization and genic expression［J］. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1951, 16：13-47.

［3］ Franz G, Savakis C. Minos, a new transposable element from Drosophila hydei, is a member of the Tc1-like family of transposons［J］. Nucleic Acids Research, 1991, 19（23）：6646.

［4］ Hirochika H, Fukuchi A. Transposable elements in rice plants [J]. Jpn Agr Res Q, 1992, 25：230-237.

［5］ Amutan M, Nyyssonen E, Stubbs J, et al. Identification and cloning of a mobile transposon from Aspergillus niger var. awamori［J］. Current Genetics, 1996, 29（5）：468-473.

［6］ Nagy Z, Chandler M. Regulation of transposition in bacteria［J］. Research in Microbiology, 2004, 155：387-398.

［7］ Koga A, Inagaki H, Bessho Y, et al. Insertion of a novel transposable element in the tyrosinase gene is responsible for an albino mutation in the medaka fish, Oryzias latipes［J］. Molecular and General Genetics, 1995, 249（4）：400-405.

［8］ Koga A, Suzuki M, Inagaki H, et al. Transposable element in fish［J］. Nature, 1996, 383：30.

［9］ Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, et al. Molecular reconstruction of sleeping beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells［J］. Cell, 1997, 91：501-510.

［10］ 鄒曙明, 杜雪地, 袁劍, 等. 金魚(yú)hAT 家族轉(zhuǎn)座子Tgf2 的克隆及其結(jié)構(gòu)［J］. 遺傳, 2010, 32：1203-1208.

［11］ Urasaki A, Mito T, Noji S, et al. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster［J］. Gene, 2008, 425：64-68.

［12］ Kawakami K, Koga A, Hori H, et al. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio［J］. Gene, 1998, 225：17-22.

［13］ Kawakami K, Imanaka K, Itoh M, Taira M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis［J］. Gene, 2004, 338（1）：93-98.

［14］ Kawakami K, Noda T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells［J］. Genetics, 2004, 166（2）：895-899.

［15］ 朱作言, 許克圣, 謝岳峰, 等. 轉(zhuǎn)基因魚(yú)模型的建立［J］. 中國(guó)科學(xué)（B 輯）, 1989, 2：147-155.

［16］ 謝岳峰, 劉東, 鄒鈞, 等. 泥鰍受精卵的電脈沖基因轉(zhuǎn)移［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 1989, 13（4）：387-389.

［17］ 于建康, 閻維. 精子介導(dǎo)魚(yú)類(lèi)基因轉(zhuǎn)移和聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)［J］. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 1994, 40（1）：96-99.

［18］ 朱作言, 汪亞平. 轉(zhuǎn)基因魚(yú). 生物學(xué)通報(bào)［J］ , 1999, 34（5）：1-3.

［19］ 柳曉瑜, 王豪博, 仇雪梅, 等. 斑馬魚(yú)兩種轉(zhuǎn)基因方法的比較［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2011（12）：205-209.

［20］ Nakanishi A, Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods［J］. Molecular Reproduction and Development, 1993, 36：358-261.

［21］ Sumiyama K, Kawakami K, Yagita K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection［J］. Genomics, 2010, 95（5）：306-311.

［22］ Rosen E, Sivertsen A, Firtel RA. An unusual transposon encoding heat shock inducible and developmentally regulated transcripts in Dictyostelium［J］. Cell, 1983, 35（1）：243-251.

［23］ Streck RD, MacGaffey JE, Beckendorf SK. The structure of hobo transposable elements and their insertion sites［J］. The EMBO Journal, 1986, 5（13）：3615-3623.

［24］ Sommer H, Carpenter R, Harrison RJ, et al. The transposable element Tam3 of Antirrhinum majus generates a novel type of sequence alterations upon excision［J］. Molecular and General Genetics MGG, 1985, 199（2）：225-231.

［25］ Kawakami K. Tol2：a versatile gene transfer vector in vertebrates［J］. Genome Biology, 2007, 8（Suppl 1）：S7.

［26］ Kawakami K, Shima A, Kawakami N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97（21）：11403-11408.

［27］ Koga A, Hori H, Sakaizumi M. Gene transfer and cloning of flanking chromosomal regions using the medaka fish Tol2 transposable element［J］. Marine Biotechnology, 2002, 4（1）：6-11.

［28］ Sato Y, Kasai T, Nakagawa S, et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos［J］. Developmental Biology, 2007, 305（2）：616-624.

［29］ Suster ML, Kikuta H, Urasaki A, et al. Transgenesis in zebrafish with the Tol2 transposon system［M］//Cartwright EJ. Transgenesis Techniques, Humana Press, 2009, 561：41-63.

［30］ 陳婷芳, 羅娜, 謝華平, 等. 利用Tol2 轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26（2）：230-236.

［31］ Kawakami K, Takeda H, Kawakami N, et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish［J］. Developmental Cell, 2004, 7（1）：133-144.

［32］ Parinov S, Kondrichin I, Korzh V, et al. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo［J］. Developmental Dynamics, 2004, 231（2）：449-459.

［33］ Asakawa K, Kawakami K. The Tol2-mediated Gal4-UAS method for gene and enhancer trapping in zebrafish［J］. Methods, 2009, 49（3）：275-281.

［34］ Liu GS, Zhang ZH, et al. Study on integration, expression and biological effects of porcine growth hormone gene in transgenic goldfish［J］. Developmental and Reproductive Biology, 1998, 7（1）：25-31.

［35］ 劉艷紅, 肖調(diào)義, 蘇建明, 等. 用顯微注射法將綠色熒光蛋白基因?qū)虢痿~(yú)受精卵中表達(dá)［J］. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 11（2）：102-105.

［36］ 胡瑩瑩, 郭學(xué)雙, 周陽(yáng), 等. piggyBac 轉(zhuǎn)座子在金魚(yú)及泥鰍轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012, 36（10）：1473-1481.

［37］ 杜雪地. 金魚(yú)Tgf2 轉(zhuǎn)座子的研究及其轉(zhuǎn)基因應(yīng)用［D］. 上海：上海海洋大學(xué), 2011.

［38］ Urasaki A, Morvan G, Kawakami K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the sub-terminal region essential for transposition［J］. Genetics, 2006, 174（2）：639-649.