陳秀玲 李景富 張麗莉 張俊峰 王傲雪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

隨著市場需求量的增加，果蔬的種植面積越來越大，特別是保護(hù)地栽培面積的增加，病害的防控成為生產(chǎn)環(huán)節(jié)的重中之重。傳統(tǒng)的化學(xué)防治，不僅造成果蔬上的農(nóng)藥殘留，危及人畜健康，而且嚴(yán)重的污染環(huán)境，已不符合當(dāng)前人們對(duì)品質(zhì)生活的要求。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致了耐藥性菌株的出現(xiàn)，使防治效果不斷下降［1-3］。運(yùn)用微生物進(jìn)行生物防治是一種有效的防治手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用也逐漸體現(xiàn)［4］。近年來，越來越多的微生物被分離和鑒定出來，用于生物防治的研究［5，6］。

真核生物的rRNA 基因是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，由18S、5.8S 和28S rRNA 聯(lián)結(jié)組成1 個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)（ITS）分開［7］。其中核糖體RNA 中的ITS 序列的進(jìn)化速率較快，已被廣泛用于探討屬內(nèi)種間甚至種內(nèi)個(gè)體間的遺傳關(guān)系。在動(dòng)物、高等植物、真菌以及藻類等種質(zhì)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究中發(fā)揮了重要作用［8-11］。

本實(shí)驗(yàn)室從草炭土中分離得到一株生防真菌，對(duì)多種病害均能起到抑制作用。本研究在對(duì)該菌生防作用研究的基礎(chǔ)上，對(duì)其5.8S rDNA-ITS 的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)其遺傳分類地位進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步利用該菌進(jìn)行生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試生防菌從吉林市郊草炭土中分離得到，供試病原菌番茄灰霉病（Botrytis cinerea）、番茄葉霉病（Cladosporium fulvum）、番茄綿疫病（Phytophthora parasitica）、番茄黃萎病（Vertillium dahliae）、番茄枯萎病（Fusarium wilt）、楊樹爛皮病（Valsa sordida Nit.）、楊樹枯萎?。ˋlternaria）、黑穗醋栗葉斑?。≒seudopeziza ribis Kleb.）病原真菌由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 供試生防菌的分離 采用平板分離法，每升分離培養(yǎng)基包含MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO40.8 g、KCl 0.15 g、NH4NO31 g、葡萄糖3 g 和瓊脂20 g。高壓滅菌后，加入終濃度為0.5 g/L 的氯霉素制備分離平板，以抑制細(xì)菌的生長。取1 g 土樣，溶解于9 mL 無菌水中，涂布平板后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待長出菌落后，轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato-dextrose agar，PDA）上，進(jìn)行單孢分離。取純化的菌落，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 供試菌株抑菌效果分析 利用對(duì)峙培養(yǎng)法，對(duì)供試菌株生防作用進(jìn)行研究。生防菌與病原菌分別接種于相同組分的PDA 培養(yǎng)基上活化，然后分別從各活化菌落邊緣用打孔器打下10 mm 直徑的菌絲餅，將病原菌分別與生防菌對(duì)峙培養(yǎng)。生防菌菌絲餅與病原菌菌絲餅間距離為4 cm，并以單獨(dú)培養(yǎng)的病原菌菌絲餅為對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)培養(yǎng)皿在22℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別在接種后第4 天、第8 天測量菌落生長直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算公式為：抑菌率（%）=［（對(duì)照平均直徑-處理平均直徑）/對(duì)照平均直徑］×100%。

1.2.3 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析 供試生防菌與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)在同一個(gè)培養(yǎng)皿中，兩種菌接種間距為1 cm，在共培養(yǎng)的3、4、5、6 和7 d 分別取樣，以供試生防菌和番茄灰霉病菌的單獨(dú)培養(yǎng)為對(duì)照，掃描電鏡下觀察不同培養(yǎng)時(shí)間兩種菌間的相互作用。

1.2.4 供試菌株基因組DNA 提取 從生長10 d 的PDA 固體培養(yǎng)基上刮取100 mg 菌絲體，在液氮中迅速研磨，基因組DNA 提取采用改良CTAB 法［12］。經(jīng)5 μL RNaseA（10 mg/mL）的消化后，DNA 沉淀溶于30 μL ddH2O 中，經(jīng)瓊脂糖電泳及分光光度計(jì)檢測后保存到-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 供試菌株5.8S rDNA-ITS 基因片段擴(kuò)增 5.8S rDNA-ITS 基因片段擴(kuò)增采用引物ITS4 5'-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-CCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3'［13］。PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括DNA模板25 ng，上下游引物各1 μL，PCR 緩沖液（10×）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，0.5 U Taq 酶1.0 μL，用ddH2O 補(bǔ)齊25 μL。擴(kuò)增條件：94℃變性3 min；94℃變性40 s，52℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35 次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）純化PCR 產(chǎn)物，peasy-T1 cloning vector試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接、轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取單克隆進(jìn)行PCR 檢測，陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 序列比對(duì)利用NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 的BlastX 工 具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行，序列多重比對(duì)利用EBI數(shù)據(jù)庫的Clustal 在線工具（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）和Clustalx 2.012 軟 件 進(jìn)行［14］。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建利用MEGA 5.0（http：//www.megasoftware.net/）［15］，采用相鄰連接法（Neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)構(gòu)建的樹進(jìn)行自檢（Bootstrap），重復(fù)設(shè)定為1 000 次。

2 結(jié)果

2.1 供試生防菌的獲得及菌株抑菌效果分析

分離到的菌株培養(yǎng)初期菌落為白色，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸轉(zhuǎn)黃；在光照條件下為粉紅色或橘紅色。抑菌試驗(yàn)（圖1）表明，供試生防菌對(duì)供試病原菌都有一定抑制作用，抑菌效果隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸提高。供試生防菌與病原菌接觸后病原菌菌落直徑不再增加，而供試生防菌逐漸侵入病原菌生長圈。在培養(yǎng)后8 d 供試生防菌對(duì)B. cinerea、P. parasitica、P. ribis Kleb.抑菌率達(dá)87.5%，對(duì)Vertill- ium dahliae、Alternaria、F. wilt、C. fulvum 和V. sordida Nit.的抑菌率分別為80%、78%、75%、62.8%和62.5%，說明供試生防菌具有一定的抑菌作用。

圖1 抑菌效果分析

2.2 供試菌株與番茄灰霉病病原菌共生的掃描電鏡分析

供試菌株與番茄灰霉病菌共培養(yǎng)時(shí)，番茄灰霉病的生長受到明顯抑制。在共培養(yǎng)3 d 時(shí)，兩種菌的菌絲剛剛接觸，灰霉病病原菌的生長幾乎未受到影響（圖2-A）。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增長（5 d），B. cinerea 的受抑制狀況明顯加強(qiáng)（圖2-B）。到了共培養(yǎng)后期（7 d），灰霉病菌的菌絲體較弱，且無分生孢子產(chǎn)生，而供試生防菌生長旺盛，并且產(chǎn)生大量分生孢子（圖2-C）。由此進(jìn)一步證實(shí)番茄灰霉病病原菌的生長受供試生防菌的抑制。

圖2 供試菌株與番茄灰霉病菌共生的電鏡分析

2.3 菌株DNA的提取

提取出的菌株DNA，稀釋10 倍后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，OD260/OD280>1.8，DNA 純度較好。經(jīng)計(jì)算后，DNA 濃度為396.5 ng/μL（表1）。

表1 菌株DNA 提取物純度和含量測定結(jié)果

2.4 5.8S rDNA-ITS序列分析

以基因組DNA 為模板，通過PCR 反應(yīng)，對(duì)5.8S rDNA-ITS 和18S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測序后，得到593 bp 的片段（圖3）。

圖3 18S rDNA 及 5.8S rDNA-ITS PCR 產(chǎn)物

圖4 基于5.8S rDNA-ITS 序列的多序列比對(duì)分析

將測序得到的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank/EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫中已知菌株的5.8S rRNA-ITS 經(jīng)BLAST 搜索比對(duì)及（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clus talw2/ index.html）和（http：//www.ch.embnet.org/softw are/BOX_form.html）在線比對(duì)，得知5.8S rDNA-ITS序列包括了菌株的部分18S rDNA、全部ITS1、5.8S rDNA、ITS2 序列和部分28S rDNA 序列（圖4）。該菌株5.8S rDNA-ITS 與Bionectria ochroleuca xsd08089（淡色生赤殼菌）最為接近，其相似性達(dá)94%。結(jié)合該菌株的菌落、菌絲及分生孢子的形態(tài)特征，初步確定該菌株屬于淡色生赤殼菌。將該菌株5.8S rDNA-ITS 序列登陸GenBank，登記號(hào)為GU112754，命名為WY-1。

2.5 供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，搜索已報(bào)道的具有生防作用的真菌的5.8S rDNA-ITS 序列，進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（圖5）。以常見的木霉屬（Trichoderma）為例，木霉屬為無性型，其有性型為肉座菌屬（Hypocrea），本研究中利用5.8S rDNA-ITS 序列將T. harzianum、T. viride、T. atroviride、H. pachybasioides 和H. virens 聚為一大類，表明此進(jìn)化樹構(gòu)建成功。供試菌株WY-1與B. ochroleuca 和Clonostachys rosea 聚為一類，其中C. rosea 為B. ochroleuca 的無性型，進(jìn)一步證明了供試菌株WY-1 屬于淡色生赤殼菌。

圖5 基于5.8S rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

淡色生赤殼菌是優(yōu)良的生防菌，是一類廣泛存在于土壤中近似于木霉的植物病原真菌的重寄生菌，可寄生多種植物病原真菌的菌絲和菌核，具有較好的生防潛力，已用于防治多種植物病害。

核糖體RNA 基因（rDNA）序列分析被認(rèn)為是最能反應(yīng)物種之間遺傳關(guān)系的指標(biāo)之一［16］，真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是位于核糖體大小亞基rRNA 之間的區(qū)域，被5.8S rRNA 基因分隔為ITS1和ITS2 片段。ITS1 和ITS2 是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS 非常適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析［17，18］。

本研究通過對(duì)供試菌株的5.8S rDNA-ITS 序列的測序結(jié)果分析，確定該菌株為淡色生赤殼菌，但該菌株的5.8S rDNA-ITS 序列與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中的已知淡色生赤殼菌序列只有94%的相似性。說明該菌株在進(jìn)化過程中基因發(fā)生了突變，發(fā)育成一株新的淡色生赤殼菌菌株，可用來防治菌核病菌、尖鐮孢霉、最終極腐霉等真菌病害，在苗床使用其制成的菌劑，提高育苗與移植的成活率，保持秧苗健壯生長，被認(rèn)為是以菌治菌最有希望的生物農(nóng)藥。

4 結(jié)論

本研究對(duì)一株從草炭土中分離的生防菌進(jìn)行了抑菌作用分析，該菌對(duì)番茄灰霉病、番茄葉霉病、番茄綿疫病、番茄黃萎病、番茄枯萎病、楊樹爛皮病、楊樹枯萎病和黑穗醋栗葉斑病均有抑制作用。利用5.8S rDNA-ITS序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建表明，該菌為淡色生赤殼菌，確定了其遺傳分類地位。

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