張家林 李洋 李強(qiáng)

（大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

鯉春病毒癥（Spring viraemia of carp，SVC）是由鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV，簡(jiǎn)稱鯉春病毒）引發(fā)的危害鯉科魚類的一種急性、高致死性的傳染病。在歐洲、亞洲及北美廣泛流行，對(duì)鯉科魚類養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必報(bào)的重要疫病，《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》（2008）列為一類動(dòng)物疫?。?］。SVCV屬于彈狀病毒科（Rhabdoriridae）、水泡性病毒屬（Vesiculorirus），為單股負(fù)鏈RNA 病毒。病毒基因組包含5 個(gè)開放閱讀框（ORF），分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA聚合酶蛋白（L）［3］。其中，糖蛋白（G）是位于病毒囊膜表面的結(jié)構(gòu)及功能蛋白，與病毒的感染［4］，免疫識(shí)別［5］及病毒內(nèi)吞［6］等功能密切相關(guān)。深入研究G 蛋白對(duì)于建立新型檢測(cè)方法以及鯉春病毒血癥的防治有重要意義。

1 G 蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

G 蛋白由509 個(gè)氨基酸殘基組成，根據(jù)糖基化程度的不同，分子量介于76-88 kD［7］?？拷麼 端上游有一段信號(hào)肽序列，C 端第476-499 位氨基酸殘基之間擁有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。Roche 等［8］通過晶體衍射試驗(yàn)表明，G 蛋白是典型的Ⅱ型跨膜糖蛋白，以三聚體形式鑲嵌在病毒囊膜表面，折疊成4 個(gè)不同的區(qū)域，存在5 個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。G 蛋白的糖基化主要有兩種：O-糖基化和N-糖基化，O-糖基化位點(diǎn)主要位于氨基末端，N-糖基化位點(diǎn)可能位于28、181、338、362 和369 位點(diǎn)［9，10］。圖1 為本實(shí)驗(yàn)室采用Phyre2 在線工具預(yù)測(cè)的G 蛋白結(jié)構(gòu)。

圖1 Phyre2 工具預(yù)測(cè)的G 蛋白結(jié)構(gòu)

病毒感染時(shí)，G 蛋白可選擇性地與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，在低pH 環(huán)境刺激下促使病毒囊膜與宿主細(xì)胞融合，核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中完成內(nèi)吞［11］。G蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體（Viral neutralizing antibody），是研制鯉春病毒基因工程疫苗的重要靶點(diǎn)［12］。G 蛋白還是病毒抗原性和遺傳性差異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，Stone 等［13］根據(jù)G 蛋白基因核苷酸序列以及抗原性差異，將SVCV 基因型分成Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 和Ⅰd 四個(gè)亞型，其中Ⅰa、Ⅰd 變異度較高。研究表明：G 蛋白與病毒毒力密切相關(guān)，不同毒力毒株G 蛋白的基因序列存在差異。Gaudin 等［14］發(fā)現(xiàn)G 蛋白存在R Ⅰ和R Ⅱ兩大毒力區(qū)域，若同時(shí)發(fā)生突變，病毒毒力將明顯降低。此外，G 蛋白擁有部分高度保守基因序列，可作為鑒別病毒的依據(jù)。

2 G 蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展

病毒天然蛋白的提取需要一定的設(shè)備和工藝程序，往往得率較低，難以大量分離。隨著基因工程的發(fā)展，采用重組表達(dá)技術(shù)人工表達(dá)病毒蛋白，解決了病毒蛋白難以純化的難題，為大量制備病毒蛋白提供了條件，有效地避免病毒泄露事故。目前已經(jīng)有采用重組表達(dá)的蛋白制備單克隆抗體（Monoclonal antibody）的報(bào)道［15］，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者致力于重組表達(dá)G 蛋白，為研究G 蛋白的功能及制備抗SVCV 單克隆抗體準(zhǔn)備材料。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是發(fā)展最早，應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。通常將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過IPTG 誘導(dǎo)獲得目的蛋白［16］。它不僅操作程序簡(jiǎn)單、表達(dá)周期短，而且其表達(dá)產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他表達(dá)系統(tǒng)。張琳等［17］在表達(dá)C1 分離株G 蛋白時(shí)，將雙酶切后的G 基因片段定向克隆至原核表達(dá)載體pET21a 上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)誘導(dǎo)，目的蛋白以包涵體形式實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，經(jīng)包涵體變性、稀釋復(fù)性、分子篩層析后，純度達(dá)90%以上。楊振慧等［18］構(gòu)建包含G 蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）后實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，割膠回收包涵體、His 親和純化后制備兔抗血清，Western-blot 結(jié)果表明G 蛋白的兔抗血清能與病毒細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)生特異性反應(yīng)。但是，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏糖基化、脂肪酸?；?、磷酸化等翻譯后修飾，影響目的蛋白的生物活性及功能［19］。

為了解決上述困難，很多學(xué)者開始采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)G 蛋白，研究集中在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)上。昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前最具潛力的表達(dá)系統(tǒng)，目前已經(jīng)有近千種異源蛋白在此系統(tǒng)中得到高效表達(dá)，重組蛋白折疊正確、有一定的翻譯后修飾、易于分離純化［20］。一般是將目標(biāo)蛋白編碼序列克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上，通過同源重組構(gòu)建重組病毒DNA，進(jìn)而感染昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白。Huang 等［21］將連有鯉春病毒G 蛋白基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含穿梭載體Bacmid 的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac 中，成功構(gòu)建重組子rBacmid-SVCV/G，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9 昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒Bac-SVCV/G，采用間接免疫熒光和Western-blot 檢測(cè)到G 蛋白在昆蟲細(xì)胞膜上獲得表達(dá)，并證明了G 蛋白可以介導(dǎo)細(xì)胞融合。研究還表明，利用重組桿狀病毒Bac-CMV-EGFP 可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)魚類細(xì)胞系，使外源基因穩(wěn)定、高量的表達(dá)。

然而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不能連續(xù)表達(dá)外源蛋白，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有特定的醇氧酶基因（Alcohol oxidase，AOX）啟動(dòng)子，將外源基因通過載體整合到酵母基因組后，以甲醇作為醇氧化酶的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)AOX 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)［22］。它既保留了原核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)周期短、產(chǎn)物易純化的優(yōu)點(diǎn)，又可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行一定的加工修飾，可用于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白。付峰等［23］用穿梭載體pGAPZαA/B 構(gòu)建含鯉春病毒G蛋白基因片段的重組表達(dá)載體，經(jīng)線性化后采用電擊法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母SMD1168 菌株，斑點(diǎn)印跡結(jié)果表明重組酵母菌株成功地表達(dá)G 蛋白。

3 G 蛋白在鯉春病毒血癥預(yù)防上的應(yīng)用

3.1 在鯉春病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

目前OIE 規(guī)定的檢測(cè)SVCV 的方法是基于單克隆抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及間接免疫熒光試驗(yàn)（Indirect immunoinfluscent assay，IFA）。由于鯉春病毒變種多，制備通用的單克隆抗體較為困難，限制了該方法的應(yīng)用普及。近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要圍繞G 蛋白基因的高度保守區(qū)，建立了一些檢測(cè)SVCV方法。

3.1.1 套式RT-PCR 該方法是在RT-PCR 基礎(chǔ)上，通過引入兩套引物放大特定的DNA 片段。套式RTPCR 具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，但不適合無病檢測(cè)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。高隆英等［24］根據(jù)鯉春病毒G 蛋白編碼基因序列，經(jīng)過RT-PCR和半套式PCR 擴(kuò)增出G 蛋白編碼框的714 bp 和606 bp 片段，特異性試驗(yàn)表明該方法與其他彈狀病毒沒有交叉反應(yīng)，該方法已成為我國(guó)檢測(cè)鯉春病毒的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15805.5-2008）；Kim 等［25］在高隆英等研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法改進(jìn)，通過引入構(gòu)建的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，有效地減少了模板污染引起的假陽(yáng)性現(xiàn)象。Kountná 等［26］根據(jù)G 蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)4 條引物，建立了檢測(cè)鯉春病毒的套式RT-PCR，該方法與狗魚幼魚彈狀病毒（PFRV）等其他魚類病毒無交叉反應(yīng)，病毒細(xì)胞培養(yǎng)后其檢測(cè)靈敏度達(dá)到10-1TCID50mL-1。

3.1.2 熒光定量RT-PCR 熒光定量RT-PCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該方法可對(duì)病毒RNA 進(jìn)行定量檢測(cè)、靈敏度較套式RT-PCR 高一個(gè)數(shù)量級(jí)，有效避免交叉污染的機(jī)會(huì)。張利峰等［27］根據(jù)SVCV 的G蛋白編碼基因保守區(qū)序列，建立了快速檢測(cè)鯉春病毒的熒光RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，將病毒懸液10-6稀釋后應(yīng)用此法仍可檢出。為縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)通量，劉宗曉等［28］根據(jù)G 蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了多重實(shí)時(shí)RT-PCR 方法，能夠同時(shí)定量檢測(cè)SVCV、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血敗血癥病毒（VHSV）3 種彈狀病毒，該方法的最低檢測(cè)限分別為40 個(gè)拷貝、220 個(gè)拷貝和140 個(gè)拷貝，同時(shí)通過對(duì)80 份樣品的檢測(cè)、抗原捕捉方法和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，證實(shí)了方法的準(zhǔn)確性，可用于疾病診斷和理論研究。

3.1.3 RT-LAMP RT-LAMP 技術(shù)是通過提取病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性，采用4 條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在恒定溫度下對(duì)樣品RNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增。該技術(shù)不需要PCR 儀、程序簡(jiǎn)單快速、可檢測(cè)到pg 級(jí)的病毒RNA。Shivappa 等［29］針對(duì)從美國(guó)卡羅萊納州分離到鯉春病毒G 蛋白編碼基因設(shè)計(jì)了4 套引物進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增，證實(shí)建立的RT-LAMP 方法是特異的，靈敏度與RT-PCR 方法近似，最低檢測(cè)限為101TCID50mL-1。Liu 等［30］根據(jù)SVCV 糖蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)兩個(gè)內(nèi)引物和兩個(gè)外引物，建立了快速檢測(cè)SVCV 的一步法RT-LAMP 方法，結(jié)果表明該法可區(qū)分SVCV、PFRV、VHSV、IHNV 等彈狀病毒，且具有與半套式RT-PCR 相同的靈敏度，通過與其他檢測(cè)方法比較，證實(shí)RT-LAMP 檢測(cè)技術(shù)更適合SVCV 的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大規(guī)模監(jiān)控。

3.1.4 其他檢測(cè)技術(shù) 除了上述核酸檢測(cè)方法之外，G 蛋白作為特異性蛋白抗原，也可直接參與建立病毒免疫診斷方法。ELISA 法是歷史上較為經(jīng)典的診斷方法，目前已經(jīng)有商品化ELISA 診斷試劑盒面世（鯉春病毒血癥抗原檢測(cè)試劑盒，BIO-X），該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、直觀、重復(fù)性好，但步驟較為繁瑣費(fèi)時(shí)，需要在酶標(biāo)儀上完成檢測(cè)。隨著膠體金免疫層析技術(shù)和蛋白芯片在水產(chǎn)上的應(yīng)用，建立基于G 蛋白的新型檢測(cè)方法成為了今后一個(gè)階段的研究熱點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、靈敏地檢測(cè)SVCV 提供了可能。

3.2 在構(gòu)建DNA疫苗上的應(yīng)用

目前SVCV 相關(guān)疫苗研究集中在滅活疫苗、亞單位疫苗及DNA 疫苗。傳統(tǒng)滅活疫苗存在毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象［31］，而制備通用亞單位疫苗的難點(diǎn)在于G 蛋白的變異度較高。DNA 疫苗是繼傳統(tǒng)疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，利用基因重組技術(shù)直接將抗原蛋白編碼的外源基因?qū)媵~體細(xì)胞內(nèi)，在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。它不但具有滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，還具有適于大批量生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視［32］，具有廣闊的應(yīng)用前景。

歐陽(yáng)征亮等［33］選取鯉春病毒 G 蛋白基因N 端去信號(hào)肽的1 000 bp 的片段，構(gòu)建了糖蛋白基因的DNA 疫苗，肌肉注射后魚體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫組相對(duì)保護(hù)率為22%。Emmenegger 等［34］利用分離至北美的鯉春病毒G 蛋白基因構(gòu)建了DNA 疫苗，冷水刺激環(huán)境下進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明DNA 疫苗可明顯降低感染鯉魚的死亡率，相對(duì)免疫保護(hù)率為50%-88%。從試驗(yàn)結(jié)果來看，該DNA 疫苗具有良好的免疫原性，可作為鯉魚和其他北美魚種的預(yù)防性疫苗。Kanellos 等［35］構(gòu)造了鯉春病毒 G 蛋白基因的DNA 疫苗，金魚免疫試驗(yàn)表明，50%以上試驗(yàn)魚出現(xiàn)特異性免疫反應(yīng)，攻毒試驗(yàn)表明疫苗相對(duì)免疫保護(hù)率為48%。此外，還證明使用含CMV-Intron A 啟動(dòng)子的質(zhì)粒以及加入先導(dǎo)序列mGM-CSF 和CpG 可明顯加強(qiáng)疫苗的保護(hù)功效。

如何克服DNA 疫苗的低免疫原性及確保疫苗安全性是研制高效DNA 疫苗的關(guān)鍵。為了提高DNA疫苗免疫應(yīng)答效果，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在替換啟動(dòng)子、優(yōu)化免疫佐劑［36］以及改造宿主等方面進(jìn)行研究，而DNA 疫苗安全性的討論主要圍繞在外源基因染色體整合問題及可能引發(fā)的自身免疫反應(yīng)。

4 展望

對(duì)于G 蛋白結(jié)構(gòu)、功能研究已取得初步進(jìn)展，但到目前為止，其作用機(jī)理的研究還很缺乏。就目前的研究成果來看，G 蛋白是鯉春病毒主要的表面抗原，在病毒侵染宿主的過程中發(fā)揮重要作用，可以作為抗病毒藥物作用的靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)：針對(duì)G 蛋白的單克隆抗體具有中和活性，能消除病毒的感染能力［37］。但探討G 蛋白介導(dǎo)病毒入胞的作用機(jī)理、制備抗G 蛋白的單克隆抗體具有重要意義，將有助于開發(fā)新型病毒診斷試劑及制備高效免疫保護(hù)疫苗。在以后的研究中應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面的問題：（1）加深對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)理的研究；（2）利用生物信息學(xué)技術(shù)分析G 蛋白的抗原表位；（3）尋找G 蛋白突變影響病毒變異的直接證據(jù)。隨著各種技術(shù)手段的不斷提高，G 蛋白將在病毒檢測(cè)、抗病毒研究等方面體現(xiàn)更大的應(yīng)用價(jià)值。

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