柯飛 王赟 侯麗芳 胡興安 李佩佩

（河南城建學院生命科學與工程學院，平頂山 467036）

呼腸孤病毒（Reovirus）廣泛存在于自然界中，從最高等的脊椎動物人類到非脊椎動物、植物、真菌等物種中都有此病毒分布，是目前已知分布范圍最廣的病毒之一，與許多疾病有關(guān)，且其獨特的多節(jié)段雙鏈RNA 基因組使其成為研究病毒基因組復制及遺傳變異的好材料。根據(jù)國際病毒分類委員會第七次報告，正呼腸孤病毒屬共有4 個成員，分3 個亞群：第一個亞群包括非融合基因哺乳動物正呼腸孤病毒（Mammalian orthoreovirus，MRV）；第二個亞群為融合基因正呼腸孤病毒，包括禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）和從飛狐（Flying fox）分離到的內(nèi)爾森海灣病毒（Nelson bBay reovirus，NBV）；第三個亞群包括從狒狒體內(nèi)分離到的呼腸孤病毒（Baboon orthoreovirus，BRV）。從蛇體內(nèi)分離到的兩株呼腸孤病毒暫且將其歸為第VI 亞群［1］。哺乳動物正呼腸孤病毒（MRV）主要感染哺乳動物的呼吸道和腸道。其中人類呼腸孤病毒的感染多數(shù)是不顯性的或者只有輕微的癥狀，但某些呼腸孤病毒可引起人的呼吸道和胃腸道疾病，而MRV 在小鼠等動物中引起明顯感染癥狀，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟及肝臟損傷。MRV 的基因組為線性、雙鏈、分節(jié)段的RNA，病毒核酸由10 個RNA 節(jié)段組成，大小從約1-4 kb，編碼11 個蛋白［2］。

反向遺傳學（Reverse genetics）是相對經(jīng)典遺傳學而言的，即直接從生物體的遺傳物質(zhì)入手，通過對遺傳物質(zhì)的加工和修飾來改變生物體的性狀，從而研究遺傳物質(zhì)的改變與生物性狀的關(guān)系，相關(guān)技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學技術(shù)。反向遺傳學技術(shù)已應用到許多病毒的研究中，通過改變病毒的核酸，觀察相應的性狀改變，從而研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能、復制機制及致病機理等。近10 年來，MRV的反向遺傳學技術(shù)逐步完善并取得了許多研究進展。本文試圖對MRV 反向遺傳學操作技術(shù)的建立過程及運用該技術(shù)取得的最新成果作一簡要綜述。

1 MRV 反向遺傳學操作技術(shù)

由于MRV 基因組由多個節(jié)段組成，比較復雜，給遺傳操作帶來了難度，因而MRV 的反向遺傳學研究開始的較晚。Roner 等［3］于2001 年建立了MRV 的第一個反向遺傳學系統(tǒng)（基于MRV 感染性RNA 的反向遺傳學技術(shù)），他們將氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶（Chloramphenicol transacetylase，CAT）基因插入ST3 型MRV S2 節(jié)段，體外獲得CAT-S2 節(jié)段后，與基因組其余9 種節(jié)段同時轉(zhuǎn)入表達S2 編碼蛋白的L 細胞，在ST2 型MRV 病毒的幫助下，獲得表達CAT 蛋白的重組ST3 型MRV 病毒。而Kobayashi 等［4］進一步發(fā)展了MRV 的反向遺傳學技術(shù)（基于質(zhì)粒的MRV 反向遺傳學技術(shù)），他們將MRV 的10 個基因組節(jié)段都構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將這10 個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，在T7 RNA 聚合酶的作用下，成功獲得了MRV 病毒。下面分別對這兩種方法的基本原理和操作步驟作一概述。

1.1 基于MRV感染性RNA的反向遺傳學技術(shù)

Roner 等［5］于1990 年發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)染的MRV dsRNA 或者ssRNA 能在輔助病毒的幫助下產(chǎn)生病毒粒子，因而也將MRV 基因組RNA 稱為感染性RNA。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了基于感染性RNA 的反向遺傳學系統(tǒng)，主要操作步驟見圖1。

圖1 基于MRV 感染性RNA 的反向遺傳學技術(shù)示意圖

1.1.1 構(gòu)建插入CAT 基因的重組ST3 型MRV S2 基因組片段 CAT 基因被選擇作為外源基因。首先以ST3 型MRV 基因組為模板，擴增得到S2 節(jié)段的cDNA，然后使用CAT 基因（752 bp）替換S2 節(jié)段199-1 046 區(qū)域的核酸序列。下一步將獲得的S2-CAT 雜合片段連接在T7 啟動子序列的3'端，同時在S2-CAT 的5'端連接HDV 核酶序列和T7 終止子序列。最后將獲得的片段插入pUC18 載體，得到重組質(zhì)粒pS2-CAT13。

1.1.2 獲得感染性RNA 包括獲得ST3 型MRV 的基因組dsRNA（除去S2）和S2-CAT RNA。

提取純化ST3 型MRV 的病毒粒子，去除衣殼蛋白，得到病毒核酸。然后合成與S2 部分序列互補的寡核苷酸，并與得到的ssRNA 雜交，使用RNaseH 處理雜交后的混合物，其中的S2 由于雜交了互補序列，呈雙鏈形式，因而被RNaseH 水解，余下其他9 條ST3 型MRV ssRNA 節(jié)段。

另外使用體外蛋白合成系統(tǒng)（兔網(wǎng)織紅細胞裂解物）處理重組質(zhì)粒pS2-CAT13，在系統(tǒng)具有的T7 RNA 聚合酶作用下，生成S2-CAT RNA。

1.1.3 獲得重組病毒 將上述獲得的9 條ST3 型MRV ssRNA 節(jié)段與S2-CAT 節(jié)段混合，轉(zhuǎn)染到表達σ2 蛋白的L929 細胞中，然后感染ST2 型MRV 作為輔助病毒。5 d 后收集感染細胞，分離重組的ST3 型MRV。

1.2 基于質(zhì)粒的MRV反向遺傳學技術(shù)

Kobayashi 等［4］構(gòu)建了包含MRV 所有基因組節(jié)段的重組質(zhì)粒，利用這些質(zhì)粒建立了新的MRV 反向遺傳學系統(tǒng)，其主要步驟見圖2。

圖2 基于質(zhì)粒的MRV 反向遺傳學技術(shù)示意圖

1.2.1 構(gòu)建插入MRV 基因組節(jié)段的重組質(zhì)粒 以MRV 基因組核酸為模板，通過RT-PCR 擴增得到所有10 個節(jié)段的全長cDNA，并通過引物設(shè)計在每段cDNA 的5'端連接上T7 啟動子序列，3'端連接HDV 核酶序列，最后將得到的雜合片段插入載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒。

1.2.2 獲得重組病毒 將上述獲得的10 個重組質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入小鼠成纖維（L929）細胞，然后感染rDIs-T7pol（表達T7RNA 聚合酶的重組痘苗病毒）。在rDIs-T7pol 提供的T7RNA 聚合酶的作用下，重組質(zhì)粒開始轉(zhuǎn)錄，由于HDV 核酶序列的存在，使得轉(zhuǎn)錄的序列自我剪切得到與野生型病毒一致的3'端?？僧a(chǎn)生與野生型序列一致的10 條ssRNA，然后這10條ssRNA 開始翻譯，表達蛋白質(zhì)，啟動病毒的裝配與復制。一般在痘苗病毒感染24 h 后就可以檢測到MRV 病毒粒子的出現(xiàn)。

1.2.3 基于質(zhì)粒的MRV 反向遺傳學系統(tǒng)的優(yōu)化 采用上述系統(tǒng)，當同時轉(zhuǎn)染這10 個質(zhì)粒的時候，重組病毒的出現(xiàn)率是比較低的，24 h 的成功率大約為2-3個/106細胞?？赡苡袃蓚€原因產(chǎn)生這種結(jié)果：①能全部擁有10 個質(zhì)粒的細胞的百分比太?。虎趶馁|(zhì)粒直接轉(zhuǎn)錄的RNA 不包括5'端，并且這些RNA 的轉(zhuǎn)錄效率比病毒直接生成的RNA 的轉(zhuǎn)錄效率低。后來，Kobayashi 等［6］進一步優(yōu)化了這個系統(tǒng)，即減少質(zhì)粒的數(shù)量，將多個基因合并成單一的質(zhì)粒。最終用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為4 個。與10 個質(zhì)粒系統(tǒng)相比，病毒恢復的效率增加了很多。

另外，為了消除rDIs-T7 pol 的影響，在BHK（幼倉鼠腎細胞）細胞中轉(zhuǎn)入T7RNA 聚合酶基因，篩選得到穩(wěn)定表達T7RNA 聚合酶的BHK 細胞系BHKT7。利用這種細胞系進行MRV 的反向遺傳學操作，也獲得了較好的效果。

2 MRV 反向遺傳技術(shù)的應用

哺乳動物正呼腸孤病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括λ3（由L1 編碼）、λ2（L2）、λ1（L3）、μ2（M1）、μ1（M2）（多數(shù)為斷裂的片段μ1N 和μ1C）、σ1（S1）、σ2（S2）和σ3（S4）。其中，外殼蛋白由λ2、μ1、σ1 和σ3 組成，λ2 具有脒基轉(zhuǎn)移酶功能，μ1 與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，σ1具有細胞吸附、血凝素和血清型決定簇的作用，σ3可與dsRNA 結(jié)合具有轉(zhuǎn)錄后翻譯功能［2］。MRV 反向遺傳技術(shù)已應用于其基因組包裝、病毒粒子吸附、病毒粒子穩(wěn)定性、致病機制及細胞嗜性等方面的研究。

2.1 MRV基因組包裝信號

MRV 基因組的10 個節(jié)段均具有相同的5'和3'末端殘基，相同的末端可能是不同序列能夠包裝進同一病毒粒子的信號。Roner 等［7］利用基于RNA感染性的反向遺傳體系研究了5'端的包裝信號，將MRV S2 節(jié)段的中間部分序列用CAT 基因代替，然后檢測S2-CAT 能否被包裝進MRV 病毒粒子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2 5'端的96 個核苷酸影響S2-CAT 序列的包裝，而其中第79-81 位的3 個核苷酸是必需的。另外，通過構(gòu)建MRV M1 節(jié)段部分序列替換的M1-CAT 病毒，以及對M1 和S2 的末端序列進行交換重組，將MRV 的包裝信號定位在基因組RNA 的5'端序列而不是3'端序列［8］。

2.2 MRV與細胞表面受體的吸附作用

MRV σ1 蛋白已被證明是細胞吸附蛋白，用來與細胞表面作為病毒受體的糖蛋白分子結(jié)合。利用基于質(zhì)粒的反向遺傳學系統(tǒng)，Reiter 等［9］發(fā)現(xiàn)σ1蛋白的第198 和202-205 位氨基酸殘基對于其吸附細胞表面分子是必需的。同時，對σ1 蛋白的結(jié)構(gòu)生物學測定表明，σ1 擁有一個具有頭尾的延伸三聚體構(gòu)型，其具有3 個結(jié)構(gòu)域，3 個結(jié)構(gòu)域之間由柔性區(qū)域（Inter-domain regions，IDRs）連接。Bokiej 等［10］進一步構(gòu)建了σ1 各功能區(qū)域缺失的重組病毒，分析了σ1 各功能區(qū)對病毒吸附及復制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，σ1 的長度對于其吸附到細胞表面非常重要，IDR1和IDR2 區(qū)域分別在σ1 蛋白的穩(wěn)定組裝和病毒復制中的后脫殼過程中發(fā)揮作用。另外，F(xiàn)rierson 等［11］利用第202 位氨基酸殘基突變的MRV-σ1R202W 重組病毒研究了細胞表面受體對于MRV 致病的重要性，MRV-σ1R202W 只能結(jié)合到細胞表面的連接黏附分子JAM-A，而不能結(jié)合到其他受體，如碳水化合物等。與野生型相比，此病毒感染小鼠后，在神經(jīng)系統(tǒng)中的滴度和毒力都大為降低，表明細胞表面的碳水化合物受體在病毒的神經(jīng)毒力方面具有重要作用。

2.3 MRV病毒粒子衣殼的穩(wěn)定性

MRV 病毒粒子進入細胞后需要經(jīng)歷的過程是衣殼蛋白的解聚。在這個過程中，外衣殼蛋白σ3 最先受到細胞內(nèi)蛋白酶的裂解。不同分離株對蛋白酶的敏感性不一樣。Doyle 等［12］構(gòu)建了σ3 上不同位點突變的重組病毒，系統(tǒng)研究了不同位點突變后病毒粒子對蛋白酶的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，σ3 上第198 位、233 位、347 位和354 位氨基酸殘基突變后，病毒粒子對蛋白酶的敏感性各不相同，且第198 位突變可以回復第354 位突變的影響，表明MRV σ3 的裂解及衣殼的穩(wěn)定受到一個氨基酸殘基網(wǎng)絡的影響。

2.4 MRV的致病機制

MRV 感染機體的一個顯著癥狀是心肌炎的出現(xiàn)，而干擾素治療可以緩解這種癥狀。MRV 不同分離株誘導機體產(chǎn)生干擾素的能力不同，因而導致機體心肌病變的能力也不一樣。Irvin 等［13］利用基于質(zhì)粒的反向遺傳技術(shù)對MRV μ2 蛋白上的氨基酸殘基進行了缺失、替換或突變，突變后的病毒感染細胞和小鼠。μ2 蛋白第208 位氨基酸殘基突變的MRV抑制干擾素β 產(chǎn)生的能力減弱，進而影響病毒的復制、擴散和病毒造成的心肌病變。

σ1s 是MRV S1 節(jié)段編碼的一個非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能一直未知。Boehme 等［14］將編碼σ1s 基因的起始密碼子突變，從而得到了不表達σ1s 的重組MRV（σ1s-null）。將野生型和σ1s-null 的MRV 分別感染小鼠，兩種病毒均可以在小鼠腸道中復制，但σ1s-null MRV 不能傳播到病毒次輪復制的位置，包括腦、心臟和肝臟，進一步檢測顯示σ1s-null MRV不能到達腸系膜淋巴結(jié)，從而不能進入血液系統(tǒng)。這些結(jié)果表明σ1s 蛋白對于病毒從宿主的腸道進入血液，從而建立全身性的感染至關(guān)重要。進一步通過σ1s-null MRV 的研究顯示，σ1s 對于MRV 的血液傳播是必需的，但對于病毒在神經(jīng)系統(tǒng)的傳播不是必需的［15］。已有研究表明，MRV μ1 蛋白是MRV穿透細胞膜，引起細胞凋亡的影響因子，Danthi 等［16］利用基于質(zhì)粒的反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建了μ1 蛋白關(guān)鍵區(qū)域突變的重組病毒。μ1 蛋白φ 區(qū)域突變后的病毒透過細胞膜的能力大大減弱，進而導致細胞凋亡的能力也受到影響。這種突變病毒在小鼠體內(nèi)感染時，病毒引起的神經(jīng)毒性也大為減弱，進一步凸顯了μ1蛋白φ 區(qū)域在病毒毒力上的重要性。

2.5 MRV的細胞嗜性

MRV 的不同分離株具有不同的細胞嗜性（Cell tropism），即不同的分離株在同一細胞中展現(xiàn)出不一樣的感染性、復制時間或細胞病變。造成這種現(xiàn)象的分子機制一直不清楚。Ooms 等［17］利用反向遺傳技術(shù)研究了這種現(xiàn)象，將1 型（T1L）和3 型（T3D）MRV 進行基因組節(jié)段的互相組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒編碼的復制蛋白μ2 和RNA 依賴的RNA 聚合酶λ3與這種現(xiàn)象有關(guān)，并且μ2 蛋白第347 位氨基酸殘基對病毒的復制效率非常重要，說明MRV 不同分離株的細胞嗜性可能是由病毒復制能力的細胞特異性所決定的。

3 結(jié)語

綜上所述，MRV 反向遺傳技術(shù)的開發(fā)成功對MRV 的相關(guān)研究起到了巨大的推動作用，在病毒結(jié)構(gòu)、基因功能及致病機制方面已經(jīng)積累了若干研究資料?？梢灶A見，反向遺傳技術(shù)必將為MRV 的研究帶來更深入的進展。

另外，MRV 反向遺傳技術(shù)的成功開發(fā)必將為其他呼腸孤病毒相應技術(shù)的研究帶來啟示。如與MRV同屬正呼腸孤病毒的禽呼腸孤病毒，其對禽類養(yǎng)殖帶來危害，至今未見禽呼腸孤病毒反向遺傳技術(shù)的報道。還有對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖造成很大危害的水生呼腸孤病毒（與MRV 具有很高的進化相關(guān)性），也未見反向遺傳技術(shù)的運用。若能將反向遺傳技術(shù)運用到這兩類病毒的研究中，將會對相關(guān)病毒的致病機理和預防控制等方面起到巨大的推動作用，從而服務于禽類及水產(chǎn)養(yǎng)殖。

［1］ 張云, 劉明, 歐陽歲東, 童光志.正呼腸孤病毒及其分類學依據(jù)研究進展［J］.動物醫(yī)學進展, 2004, 25（6）：46-49.

［2］ King AMQ, Carstens E, Adams M, et al. Virus Taxonomy, 9th Report of the ICTV［M］. London：Elsevier/Academic Press, 2011, 541-637.

［3］ Roner MR, Joklik WK. Reovirus reverse genetics：Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98（14）：8036-8041.

［4］ Kobayashi T, Antar AA, Boehme KW, et al. A plasmid-based reverse genetics system for animal double-stranded RNA viruses［J］. Cell Host Microbe, 2007, 1（2）：147-157.

［5］ Roner MR, Sutphin LA, Joklik WK. Reovirus RNA is infectious［J］. Virology, 1990, 179（2）：845-852.

［6］ Kobayashi T, Ooms LS, Ikizler M, et al. An improved reverse genetics system for mammalian orthoreoviruses［J］. Virology, 2010, 398（2）：194-200.

［7］ Roner MR, Bassett K, Roehr J. Identification of the 5'sequences required for incorporation of an engineered ssRNA into the Reovirus genome［J］. Virology, 2004, 329（2）：348-360.

［8］ Roner MR, Steele BG. Localizing the reovirus packaging signals using an engineered m1 and s2 ssRNA［J］. Virology, 2007, 358（1）：89-97.

［9］ Reiter DM, Frierson JM, Halvorson EE, et al. Crystal structure of reovirus attachment protein σ1 in complex with sialylated oligosaccharides［J］. PLoS Pathog, 2011, 7（8）：e1002166.

［10］ Bokiej M, Ogden KM, Ikizler M, et al. Optimum length and flexibility of reovirus attachment protein σ1 are required for efficient viral infection［J］. J Virol, 2012, 86（19）：10270-10280.

［11］ Frierson JM, Pruijssers AJ, Konopka JL, et al. Utilization of sialylated glycans as coreceptors enhances the neurovirulence of serotype 3 reovirus［J］. J Virol, 2012, 86（24）：13164-13173.

［12］ Doyle JD, Danthi P, Kendall EA, et al. Molecular determinants of proteolytic disassembly of the reovirus outer capsid［J］. J Biol Chem, 2012, 287（11）：8029-8038.

［13］ Irvin SC, Zurney J, Ooms LS, et al. A single-amino-acid polymorphism in reovirus protein μ2 determines repression of interferon signaling and modulates myocarditis［J］. J Virol, 2012, 86（4）：2302-2311.

［14］ Boehme KW, Guglielmi KM, Dermody TS. Reovirus nonstructural protein sigma1s is required for establishment of viremia and systemic dissemination［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106（47）：19986-19991.

［15］ Boehme KW, Frierson JM, Konopka JL, et al. The reovirus sigma1s protein is a determinant of hematogenous but not neural virus dissemination in mice［J］. J Virol, 2011, 85（22）：11781-11790.

［16］ Danthi P, Coffey CM, Parker JS, et al. Independent regulation of reovirus membrane penetration and apoptosis by the μ1 φ domain［J］. PLoS Pathog, 2008, 4（12）：e1000248.

［17］ Ooms LS, Kobayashi T, Dermody TS, Chappell JD. A postentry step in the mammalian orthoreovirus replication cycle is a determinant of cell tropism［J］. J Biol Chem, 2010, 285（53）：41604-41613.