鄭飛+陳學(xué)軍

【摘要】 目的：探討GP73在PHC癌組織中的表達(dá)及其對(duì)PHC可能存在的臨床意義。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化檢測(cè)20例PHC癌組織（PHC組）和18例正常肝組織（正常對(duì)照組）中GP73蛋白以及GP73 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：PHC組GP73 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平為（1.37±0.18），明顯高于對(duì)照組的（0.53±0.04）（P<0.05）；PHC組GP73陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%（16/20），正常對(duì)照組為5.6%（1/18），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；PHC組中GP73蛋白表達(dá)量與GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量存在明顯正相關(guān)性（r=0.76，P<0.05）。結(jié)論：GP73在PHC癌組織中呈高表達(dá)，GP73能作為一種有臨床意義的肝癌標(biāo)志物，為PHC的診斷提供可靠的標(biāo)記。

【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌； PCR； 免疫組化； GP73； 腫瘤標(biāo)記物

The Expression of GP73 in Primary Hepatic Carcinoma and Its Clinical Significance/ZHENG Fei，CHEN Xue-jun.//Medical Innovation of China，2014，11（01）：013-014

【Abstract】 Objective：To explore the expression of GP73 in primary hepatic carcinoma and its possible clinical significance to primary hepatic carcinoma. Method： The expression of GP73 protein and mRNA in 20 cases of primary hepatic carcinoma （PHC group） and 18 cases of normal liver （normal control group） were examined by immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction. Result： The mean level of GP73 mRNA expression in the PHC group was （1.37±0.18）， and significantly higher than the normal control group of （0.53±0.04） （P<0.05）； GP73 protein positive rate of the PHC group was 80.0%， the normal control group was 5.6%， showed significant difference between two groups （P<0.05）； in the PHC group， relative quantity of GP73 protein expression and GP73 mRNA expression had a significantly positive correlation （r=0.76， P<0.05）. Conclusion： GP73 protein is highly expressed in primary hepatic carcinoma， and may serve as a reliable tumor marker for diagnosis of primary hepatic carcinoma with potential clinical significance.

【Key words】 Primary hepatic carcinoma； PCR； IHC； GP73； Tumor marker

First-authors address：Department of Pathology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.01.006

原發(fā)性肝癌（Primary Hepatic Carcinoma，PHC）為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在腫瘤中高居第五位，死亡率居第三位。研究顯示，未接受治療的PHC患者的5年生存率低于5%，PHC的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)改善患者的生存率和預(yù)后扮演著重要的角色。甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein，AFP）為應(yīng)用最廣泛的肝癌腫瘤血清標(biāo)志物，然而25%～30%的PHC患者血清AFP水平正常，且在慢性肝臟疾病中，例如慢性肝炎和肝硬化，AFP也常呈高水平表達(dá)。因此AFP對(duì)于PHC的診斷存有一定的不足。GP73是與病毒性肝炎感染、肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的糖蛋白，對(duì)診斷鑒定肝癌上發(fā)揮著一定作用。因此本研究借助逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），探究了GP73在PHC的表達(dá)及其可能的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年-2012年本院收治的PHC患者20例為PHC組，均符合《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前均未進(jìn)行放化療，其中男12例，女8例，年齡30～68歲，平均48.2歲，肝癌標(biāo)本切下后立刻轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存待檢；同期選取無(wú)其他疾病的肝血管瘤患者18例為正常對(duì)照組，經(jīng)病毒學(xué)檢查確診無(wú)病毒感染，其中男11例，女7例，年齡33～64歲，平均46.5歲，對(duì)照肝組織取自肝血管瘤切除術(shù)后的瘤旁正常肝組織。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR Trizol法提取組織RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。GP73上下游引物分別為：5-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3和5-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3；α-tubulin內(nèi)參的上下游引物分別為：5-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3以及5-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；退火30 s，GP73退火溫度為65 ℃，α-tubulin則為57 ℃；72 ℃，1 min；40個(gè)循環(huán)后，72 ℃維持5 min。電泳后成像，利用Quantity One計(jì)算GP73和α-tubulin的A值，GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量=GP73的A值/α-tubulin的A值。

1.2.2 IHC 組織常規(guī)固定脫水后石蠟包埋，制成5 μm切片，脫蠟進(jìn)水，雙氧水浸泡，CB法修復(fù)抗原，血清封閉。滴加抗GP73一抗（小鼠抗人GP73多克隆抗體，北京熱景生物）并于37 ℃下孵育2 h。PBS洗滌后加入二抗（HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗，北京中杉金橋）并于37 ℃下孵育1 h。PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，吹干封片，鏡檢。陰性對(duì)照中用PBS替代一抗，用已知陽(yáng)性組織切片充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照。按照Berry分級(jí)法進(jìn)行IHC半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析兩個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GP73的表達(dá)比較 PHC組切除的肝組織中，GP73陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%（16/20），IHC顯示GP73主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色或黃褐色顆粒狀染色；正常對(duì)照組肝組織中GP73陽(yáng)性表達(dá)率為5.6%（1/18）。兩組GP73陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 兩組GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 RT-PCR結(jié)果顯示，GP73 mRNA在PHC組肝組織中為高表達(dá)，在正常對(duì)照組的肝組織中為低表達(dá)或不表達(dá)；PHC組GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.37±0.18），正常對(duì)照組為（0.53±0.04），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 GP73蛋白表達(dá)級(jí)別與GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)性分析表明兩者存在明顯的正相關(guān)性（r=0.76，P<0.05）。

3 討論

近幾十年來(lái)，PHC為全球范圍內(nèi)高發(fā)的10種惡性腫瘤之一，它發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差、死亡率高，其死亡率高居第三[1]。及早診斷以及治療PHC是提高PHC患者生存率的關(guān)鍵所在。然而，現(xiàn)今及早診斷PHC的醫(yī)學(xué)手段主要有影像學(xué)以及腫瘤血清標(biāo)志物（例如傳統(tǒng)意義的AFP）篩查。GP73（高爾基體蛋白73）是近年來(lái)出現(xiàn)的具有一定潛力新型肝癌腫瘤標(biāo)志物。在正常肝臟組織中GP73的表達(dá)非常低，然而GP73在病變肝細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)出上升[2-4]。Marrero[5]的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)352例PHC患者的血清標(biāo)本進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，他們發(fā)現(xiàn)PHC患者血清GP73水平顯著高于肝硬化者，GP73早期診斷PHC的敏感度也明顯高于AFP，暗示GP73有望成為一種有潛力的新型PHC腫瘤標(biāo)記物。而后的研究同樣也證明GP73診斷PHC的敏感度和特異度均高于AFP[6-8]。

現(xiàn)今對(duì)GP73的研究主要聚焦在血清學(xué)水平，關(guān)于PHC癌組織GP73蛋白表達(dá)及其mRNA表達(dá)的研究并不多。鑒于此，本研究采用IHC技術(shù)，發(fā)現(xiàn)PHC癌組織中GP73的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.0%，正常肝組織僅為5.6%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這一結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果呼應(yīng)[6，9-10]，說(shuō)明GP73是較AFP要敏感的PHC腫瘤標(biāo)記物；此外，憑借RT-PCR技術(shù)本研究發(fā)現(xiàn)，PHC癌組織中GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量（1.37±0.18）也高于正常肝組織的（0.53±0.04）（P<0.05），PHC組織中GP73蛋白表達(dá)量與GP73 mRNA相對(duì)表達(dá)量之間存有正相關(guān)性（P<0.05），這一結(jié)果再次肯定了本研究前面的發(fā)現(xiàn)。目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程通常伴隨著亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及功能的轉(zhuǎn)變，而高爾基細(xì)胞器是個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，高爾基體具有很多與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白?？紤]到上述事實(shí)，筆者的研究結(jié)果提示高爾基體膜蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分相關(guān)，并且可能對(duì)腫瘤的惡性表型的維持起著十分重要的作用。

總之，本研究的結(jié)果證實(shí)GP73在PHC癌組織中表達(dá)顯著升高，提示GP73可以作為一種有臨床意義的肝癌標(biāo)志物，為PHC的診斷提供可靠的蛋白標(biāo)記。雖然本研究結(jié)果表明GP73用于PHC診斷有較好的敏感性，但GP73表達(dá)水平與肝癌進(jìn)展關(guān)系則需要深入研究。

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（收稿日期：2013-08-05） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2013-08-05） （本文編輯：蔡元元）