辛嘉英，王 艷，張超越，陳林林

(1.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

辣椒素酯類(capsiate)物質(zhì)，是20世紀80年代末從日本的一種甜椒品種中分離得到的一種結(jié)構(gòu)類似辣椒素的酯類物質(zhì)(圖1)，生物活性與辣椒素類似[1-2]，動物實驗表明它具有促進能量代謝、增強肌體免疫功能等作用，細胞毒性比辣椒素低，有替代辣椒素的廣闊應用前景，特別是由于它無辣味，在增加實驗鼠的兒茶酚胺分泌、促進能量代謝、抑制體內(nèi)脂肪積累方面有替代辣椒素類物質(zhì)的巨大潛力，因此越來越受到人們的青睞[3-11]。

圖 1 辣椒素類物質(zhì)和辣椒素酯類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of capsaicinoids and capasinoids

1 辣椒素酯類物質(zhì)合成的研究進展

國外關(guān)于辣椒素酯類物質(zhì)的研究最早始于日本，而目前具有一定意義的研究成果也大部分來自于日本，俄羅斯的研究者Edmundo等[12]也于2007年開始對辣椒素酯類物質(zhì)進行研究，而在我國最早進行辣椒素酯類物質(zhì)研究的是董新榮[13-14]、李雨虹[15]等，對丙酮中化學-脂肪酶法催化辣椒素與香草醇合成辣椒素酯類物質(zhì)及其生物活性進行了研究，在開發(fā)新型用于辣椒素酯類物質(zhì)合成的脂肪酶上也作出了一定的貢獻。

1.1 辣椒素酯類物質(zhì)化學合成的研究進展

當香草醇(vanilly alcohol)與相應的辣椒素的脂肪酸形成的酯類化合物被定義為辣椒素酯類物質(zhì)(capsinoids)后，Kobata等[1]為了確認其結(jié)構(gòu)，進行了二氫辣椒素的化學合成研究。首先8-甲基壬酸與SOCl2作用轉(zhuǎn)化為酰氯，再與香草醇在吡啶介質(zhì)中反應，生成的產(chǎn)物用硅膠柱色譜法進行純化的目標化合物，收率為36.8%。Kouzou等[16]為了研究辣椒素酯類化合物在不同有機溶劑中的穩(wěn)定性，用同樣的方法合成了包括壬酸香草醇酯等的辣椒素酯類化合物及其衍生物。主要合成通式如圖2所示。

圖 2 辣椒素酯類物質(zhì)的化學合成路線Fig.2 Route of chemical synthesis of capasinoids

1.2 辣椒素酯類物質(zhì)酶催化合成的發(fā)展歷程

Hideshi等[17]于1980年，首次從酶催化的角度進行辣椒素酯類物質(zhì)生物合成的研究，在酶催化香草胺與C9～C11的脂肪酸合成辣椒素酯類物質(zhì)中酶的催化特性和從辣椒細胞中分離出來的酶對不同鏈長的脂肪酸的催化活性等方面進行了研究。他們的研究成果為進一步研究酶催化辣椒素的酯類物質(zhì)的合成奠定了必要的理論基礎并提供了可靠的技術(shù)指導。使由酶直接催化合成辣椒素酯類物質(zhì)成為可能，但此項技術(shù)并沒有迅速發(fā)展起來，直到1996年才有了進一步的研究成果。辣椒素酯類物質(zhì)的酶催化合成主要是通過用不同碳鏈長度的脂肪酸(C4～C16)將辣椒素上的酰胺鍵替換成相應的酯鍵而獲得的一類物質(zhì)。還包括將取代芳香環(huán)上的—OH和—OCH3取代后而獲得的一系列物質(zhì)[18]。

1996年，Kobata等[19]用牛肝的丙酮干粉催化香草胺的鹵化物和一些脂肪酸合成沒有辛辣味的辣椒素類似物。此研究進一步證實辣椒素的類似物可以通過酶催化的方法合成，為生物合成辣椒素酯類物質(zhì)開拓了新的研究方向。1998年，該研究組[20]研究發(fā)現(xiàn)一些脂肪酶可以催化香草胺和脂肪酸反應生成辣椒素酯類物質(zhì)，而且催化活性較好，其中較為適宜的是Lipase PS和Novozym 435兩種脂肪酶，同時也對不同碳鏈的脂肪酸對產(chǎn)量的影響進行了研究，14個碳的脂肪酸的產(chǎn)量最高。此研究為生物合成辣椒素酯類物質(zhì)找到了較為理想的催化劑，是脂肪酶催化天然辣椒素酯類物質(zhì)的生物合成的開端。在此之后，更多研究者開始對酶催化反應的反應機理進行深入研究。Dolores等[21]于2000年發(fā)現(xiàn)辣椒素可以在一定條件下通過酶催化發(fā)生水解反應，水解成香草胺和8-甲基-6-壬酸。并通過實驗發(fā)現(xiàn)脂肪酶Novozym 677 BG和Novozym 435、酯酶、胰蛋白酶和青霉素?；付伎梢允估苯匪匕l(fā)生不同程度的水解，但在Novozym 435的催化下辣椒素的轉(zhuǎn)化率最高。此發(fā)現(xiàn)為研究者之后將辣椒素轉(zhuǎn)酯化成辣椒素酯類物質(zhì)提供了參考，將辣椒素酯類物質(zhì)合成的關(guān)注點由酶催化酯化合成轉(zhuǎn)移到了酶催化轉(zhuǎn)酯化合成上，使得辣椒素酯類物質(zhì)的合成產(chǎn)生了許多具有突破意義的研究成果。2001年，Hiroki等[22]用化學-酶法進行離子液中辣椒素與糖基反應生成辣椒素糖類物質(zhì)的研究，首先是辣椒素在離子液中，在有乙氰、碳酸鉀和甲醇存在的條件下與四乙酰-α-D-葡萄糖氟化物經(jīng)化學反應生成辣椒素-β-D-吡喃葡萄糖苷，之后辣椒素-β-D-吡喃葡萄糖苷在有氯化鈣存在和環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的催化下與淀粉發(fā)生糖基化反應生成辣椒素低聚糖類物質(zhì)。該類物質(zhì)不僅保留了辣椒素的一些生物活性而且水溶性的提高使其更易于人體消化吸收，生物活性和藥理作用更易于發(fā)揮，使得辣椒素糖基類物質(zhì)更適合在食品和醫(yī)藥行業(yè)上應用，從而大大提高了其應用價值。2002年，Kobata等[23]以脂肪酶為催化劑，以脂肪酸甲酯與香草醇在二氧六環(huán)的500μL反應體系中通過酯交換合成了包括脂肪酸鏈為C6/C9/C14/C18的一系列類似化合物，產(chǎn)物最終以制備型高效液相色譜純化，收率達到59%～77%。在取得酶催化的合適反應條件后，再以化學-酶法進行了天然辣椒素轉(zhuǎn)化為天然辣椒素酯的實驗研究，也就是先用甲醇醇解辣椒素，醇解后獲得的相應脂肪酸再由脂肪酶催化與香草醇發(fā)生酯化反應生成目標產(chǎn)物辣椒素酯類物質(zhì)。2007年，Edmundo等[12]研究出了一條新型的辣椒素酯類物質(zhì)的合成途徑，即正己烷中脂肪酶催化辣椒素酯類物質(zhì)的一步合成法(圖3)，此方法是完全由一種脂肪酶催化的生物合成法，在整個過程中辣椒素并沒有發(fā)生水解而是發(fā)生了醇解反應，在脂肪酶的催化下辣椒素分解釋放出香草胺后剩余的部分與脂肪酶形成了酶-?；鶑秃衔?，之后該復合物再與香草醇發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應生成辣椒素酯類物質(zhì)并釋放出酶，從而完成整個反應。該方法省去了辣椒素用化學法甲醇醇解的工藝流程，避免了化學-酶法合成辣椒素酯類物質(zhì)的一些弊端(無有機溶劑的引入、節(jié)能、減少污染等)，簡化了合成工藝。同年，Edmundo等[18]在之前的研究基礎上，通過改變?；w的鏈長和芳香環(huán)上的取代基來進一步研究辣椒素酯類物質(zhì)的脂肪酶催化合成，通過研究發(fā)現(xiàn)辣椒素的酯類物質(zhì)的初始合成速率與?；w的鏈長無關(guān)而與芳香環(huán)的取代基有關(guān)。

圖 3 辣椒素酯類物質(zhì)的一步合成路線(醇解)Fig.3 Route of one-step synthesis of capasinoids

2010年，Kohji等[24]通過改變條件使辣椒素的水解與酯類物質(zhì)的合成在一個體系內(nèi)，在一種脂肪酶的催化下完成。也就是辣椒素在脂肪酶的催化下發(fā)生水解生成香草胺和相應的脂肪酸，辣椒素相應的脂肪酸部分再與香草醇在同一脂肪酶的催化下合成了辣椒素的酯類物質(zhì)，如圖4所示。

圖 4 辣椒素酯類物質(zhì)的一步合成路線(水解)Fig.4 Route of one-lipase catalyzed synthesis of capasinoids

2011年，劉紹等[25]對脂肪酶Novo435在丙酮介質(zhì)中催化香草醇與壬酸甲酯合成辣椒素酯的反應動力學特性進行了研究，建立了動力學方程。在催化反應過程中，甲醇生成對酶催化反應的速率有一定的抑制作用。本反應中甲醇的最大生成量為0.45mol/L，對合成反應速率的抑制約為20%。實驗中發(fā)現(xiàn)香草醇在丙酮中的最大溶解度是0.7mol/L，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為65%，因此提出通過對香草醇進行修飾提高其溶解度的方法來提高辣椒素酯類產(chǎn)物的濃度。

1.3 生物合成途徑的研究進展

圖 5 辣椒素酯類物質(zhì)的化學-酶法合成路線Fig.5 Route of chemical-enzymatic synthesis of capasinoids

目前，生物合成辣椒素酯類物質(zhì)有3種途徑，包括化學-酶法合成途徑、酶水解-酶法合成途徑和酶催化轉(zhuǎn)酯化一步反應合成途徑。

化學-酶法合成途徑[26]，是首先將辣椒素用化學法進行甲醇醇解生成香草胺和與辣椒素相應的脂肪酸，這相應的辣椒素的脂肪酸在脂肪酶的催化下與香草醇發(fā)生酯化反應合成辣椒素酯類物質(zhì)，合成工藝如圖5所示。

酶水解-酶法合成途徑[18]，是反應所用的酶既可以使辣椒素發(fā)生水解反應(A)，同時也可以催化辣椒素相應的脂肪酸與香草醇發(fā)生酯化反應(B)，首先是辣椒素(1)在脂肪酶的作用下發(fā)生水解，生成香草胺(2)和辣椒素相應的脂肪酸(3)，后者再與香草醇(4)發(fā)生酯化反應生成辣椒素酯類(5)物質(zhì)，合成工藝如圖6所示?？梢钥闯觯磻w系中含水量高利于A反應，而低含水量才利于B反應，因此采用合理的方法有效控制反應體系中的含水量是反應朝目標反應進行的關(guān)鍵。

圖 6 辣椒素酯類物質(zhì)的酶水解-酶法合成路線Fig.6 The route of enzymatic hydrolysis-enzymatic synthesis of capasinoids

酶催化轉(zhuǎn)酯化一步反應合成途徑(enzymatic transacylation one-pot strategy)[12]，是辣椒素在脂肪酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應，生成酶-辣椒素相應的脂肪酸酯復合物(EF complex)并釋放出香草胺，生成的EF complex在?；荏w香草醇存在條件下再次酯交換生成辣椒素酯類物質(zhì)并釋放出游離酶，合成工藝如圖7所示。

這3種途徑中，化學-酶法途徑是最早研究出來的也是目前應用較為廣泛的一種方法，而且其在40h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率則可高達80%以上，但是化學醇解過程的反應條件要求較為嚴格，而且有機溶劑和加熱回流等一系列操作不僅使反應工藝變得繁瑣，同時也增加了成本，對環(huán)境也造成了污染。而酶水解-酶法合成途徑和酶催化轉(zhuǎn)酯化一步反應機制合成途徑的主要區(qū)別就在于體系內(nèi)水活度不同，前者需要在一個較為適宜的水活度的條件下才能夠達到理想的效果，而后者則是在絕對低水活度的條件下才能實現(xiàn)。除了水活度的條件不同以外，其他的反應條件基本相似，但酶水解-酶法合成途徑的反應效果要優(yōu)于酶的乒乓機制合成途徑，前者的轉(zhuǎn)化率在35h內(nèi)高達60%以上，而后者在80h的轉(zhuǎn)化率僅為前者的一半左右。

圖 7 辣椒素酯類物質(zhì)的酶催化轉(zhuǎn)酯化一步反應合成路線Fig.7 Route of enzymatic transacylation one-step synthesis of capasinoids

1.4 辣椒素酯類物質(zhì)的分析方法

無論是從辣椒中提取出來的辣椒素酯類物質(zhì)還是用現(xiàn)有的3種合成途徑合成的辣椒素，都要經(jīng)過純化，定性、定量以及化學結(jié)構(gòu)的分析。目前，一般都采用硅膠柱層析法進行純化，高效液相色譜法進行定性和定量分析，而化學結(jié)構(gòu)則要通過1H NMR和13C NMR以及氣質(zhì)兩用技術(shù)進行測定[22-24]。

1.4.1 硅膠柱層析純化條件的研究進展

硅膠柱色譜法純化起初是從辣椒素的純化研究借鑒來的，主要的純化條件是由Kobata等[1]研究得出并一直沿用至今，基本方法條件如下：硅膠G板的制作：將1g左右硅膠G慢慢地加入2mL水中調(diào)成糊狀，邊加邊攪拌。然后將調(diào)好的漿料倒在玻璃板上，用手左右搖晃，使表面均勻光滑。最后將薄層板放于平臺上晾干，于烘箱中110℃活化1h后放置干燥器中備用。展開劑為體積比4∶1的石油醚-乙酸乙酯，上行展開，揮干溶劑后碘蒸氣顯色[1,16,25]。

1.4.2 HPLC分析條件的研究進展

表 1 HPLC分析條件對比表Table 1 Comparison of analysis conditions for HPLC

1.4.3 GC分析條件的研究進展

氣相色譜一般與質(zhì)譜儀聯(lián)用，而目標產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通常通過1H NMR和13C NMR來進行分析和確定。氣相色譜的主要分析條件也是由日本的Kobata等[1]確定并一直被其他研究者使用。主要分析條件為：HP-innowax毛細管；氣化室溫度為280℃，紫外檢測器，檢測器溫度為280℃；氫氣壓力為0.05MPa，空氣壓力為0.01MPa，柱頭壓力為0.055MPa；柱溫為130℃停留0.5min，然后以2℃/min的升溫速度至138℃，15℃/min升至240℃[23-28]。

1.4.41H NMR和13C NMR對辣椒素酯類物質(zhì)的結(jié)果分析[15,19]

用CDCl3溶解待測物，以TMS為內(nèi)標，1H NMR在399.65MHz而13C NMR在100.40MHz的條件下進行測定。1HNMR譜表明，分子中存在香草基[苯環(huán)，6.88(3H, m)；酚羥基，5.74(1H, s, b)；亞甲基，5.03(2H, s)；甲氧基，3.89(3H, s)]及酯類化合物的?；炬淸COCH2，2.33(2H, t)；COCCH2，1.63(2H,m)；脂肪鏈CH2x5，1.26(10H, m)；脂肪鏈末端CH3，0.87(3H, t)]。13CNMR譜表明分子中存在香草基(146.4、145.6、127.9、122.0、114.3、111.2為苯環(huán)的6C；66.3為ph-CH2-OCO的C；55.8為OCH3的C)及酯類化合物的?；炬?173.9，C＝O；34.3、31.8、29.2、29.1(2C)、24.9、22.6，歸屬為脂肪鏈CH2x7；14.1，脂肪鏈末端CH3)，脂肪酰基部分共含有9個碳原子。李雨虹等[12]也利用了紫外分光光度法和紅外光譜法對辣椒素酯的結(jié)構(gòu)進行了分析。紫外光譜233nm及28lnm的吸收峰分別為苯環(huán)的K及B帶吸收。IR光譜3440cm-1吸收為v(Ar單鍵OH)伸縮振動；1736cm-1吸收為v(C雙鍵O)伸縮振動；1608、1518cm-1吸收為苯環(huán)v(C雙鍵C)伸縮振動；1238、1034cm-1吸收為酯鍵v(C單鍵O單鍵C)振動。

1.5 辣椒素酯類物質(zhì)的生物活性

關(guān)于辣椒素酯類物質(zhì)的生物活性的研究，自從Yazawa等[29]報道了辣椒素酯類物質(zhì)以來，人們就開始進行了研究。多年的研究表明，它雖然沒有辣椒素的辛辣味和細胞毒性，但具有辣椒素類似的生物活性，主要有加強能量代謝、抑制肥胖方面的作用，同時還具有增強免疫系統(tǒng)功能、增強運動忍耐力和止痛等作用。

1994年，Watanabe等[3]報道了辣椒素酯類物質(zhì)與辣椒素一樣具有增強腎上腺兒茶酚胺的分泌作用，因而展現(xiàn)出促進脂肪代謝、抑制肥胖的作用。2001年，Ohnuki等[30]在活鼠實驗中發(fā)現(xiàn)辣椒素酯類物質(zhì)可以使小鼠的體溫升高。在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)，辣椒素酯類物質(zhì)具有辣椒素所沒有的促進能量代謝和抑制脂肪積累的作用。他們給5周齡雄性Std ddy鼠以5mL/kg體質(zhì)量的計量喂食以CH-19 Sweet果肉制成的2g果肉/mL的液體樣品，每天3次。同時以含Capsaicin量高的辣椒和不含Capsaicin同時也不含capsiate的辣椒樣品進行對照實驗。30min后喂食含Capsaicin或Capsiate辣椒老鼠的體溫明顯高于對照組。2001年，加藤正俊等[31]對辣椒素酯類物質(zhì)作為鎮(zhèn)痛劑以及在食品與飼料添加劑的應用等方面進行了研究。研究表明辣椒素酯類物質(zhì)與辣椒素一樣具有鎮(zhèn)痛作用。研究結(jié)果顯示，以30mg/kg體質(zhì)量的計量用藥30min后具有明顯的鎮(zhèn)痛效果，2h后效果達到最佳，藥效可持續(xù)8h。2003年，Iida等[9]研究了辣椒素酯類物質(zhì)對辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid1，TRPV 1)的激活作用及傷害性反應的誘導作用，結(jié)果顯示，辣椒素酯類物質(zhì)與辣椒素一樣，能短暫激活HEK293細胞中TRPV 1的表達，相同的是在皮下注射時能誘導老鼠的傷害性反應，不同的是，辣椒素酯類物質(zhì)對表皮、眼睛或口腔沒有明顯的刺激作用，因此辣椒素酯類物質(zhì)是直接作用于神經(jīng)末稍而表現(xiàn)藥效的。2007年，Edmundo等[18]研究了辣椒素酯類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與淀粉酯類物質(zhì)辛辣刺激性之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，當脂肪酸的碳鏈長度為C8和C10時所合成的辣椒素類似物還保留了66%和36%的辛辣刺激性。然而，當碳鏈長度為C6和C12時所合成的辣椒素類物質(zhì)僅保留了2.1%和1.2%的刺激性。這說明辣椒素酯類物質(zhì)的碳鏈長度與其辛辣刺激性有很大關(guān)系。2009年，郭時印[32]對辣椒素類物質(zhì)的抗疲勞性和機理進行了深入研究。以6～15mg/kg的計量給小鼠灌胃辣椒素類物質(zhì)，每8h給小鼠灌胃一次，持續(xù)28d。28d后小鼠的體重質(zhì)量無明顯變化但小鼠的爬桿和力竭游泳時間得到顯著延長，抗缺氧的能力明顯提高。同時具有抑制運動后血乳酸和血尿素氮的生成和維持運動后小鼠肝臟和肌肉組織內(nèi)糖原的含量的作用，具有很好的抗運動疲勞的作用。2010年，Eun等[33]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素酯類物質(zhì)可以抑制紫外線引起的灼燒感。將其涂抹在皮膚的角質(zhì)層上抑制了細胞間氧的活性，而這些活性氧是細胞分裂、蛋白激酶和細胞核κB因子的激活劑，因此辣椒素可以抑制紫外線引起的灼燒感的這種生物活性，就是通過這種途徑起到作用的。2010年，Miyako等[34]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素酯類物質(zhì)同辣椒素一樣具有使觸發(fā)吞咽反射加快的功能，吞咽困難是由吞咽反射延遲引起的，是吸入性肺炎的主要癥狀，一般年老者?；加羞@種疾病。由于辣椒素具有辛辣味和一定的刺激性，不利于作為藥用和老年人及患有呼吸性疾病的人食用，因此大大限制了辣椒素在這方面生物活性上的應用，而辣椒素酯類物質(zhì)則可以替代辣椒素很好地展現(xiàn)這一生物活性的應用價值。

多年來的研究使得辣椒素酯類物質(zhì)的生物活性方面不斷被發(fā)掘，不僅在某些生物活性上其是辣椒素7的一種很好的替代品，而且也具有一些辣椒素所沒有的生物活性。它是一種很有開發(fā)潛力的食品輔助劑、藥品中主要藥效成分和化妝品的功能性成分。

2 結(jié) 語

關(guān)于辣椒素酯類物質(zhì)的研究始于20世紀80年代，雖然取得了一定的成果，但該項研究的發(fā)展速度較慢，研究內(nèi)容也比較局限。多年來，該領(lǐng)域的研究一直停留在利用脂肪酶在有機溶劑(正己烷和二氧六環(huán))體系中進行辣椒素酯類物質(zhì)的合成。因此辣椒素酯類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率較低、反應時間較長、不易于工業(yè)化生產(chǎn)仍是研究者們要繼續(xù)解決的問題。隨著生物技術(shù)手段的不斷發(fā)展，將來人們不僅要在開發(fā)新的可以應用的酶和有機溶劑上進行深入研究，也可以通過更多生物技術(shù)手段的應用來解決尚存的問題，其中無溶劑體系、擬低共溶體系、超臨界二氧化碳和離子液體等一些新技術(shù)都具有很大發(fā)展前景，這些技術(shù)的理論基礎扎實，技術(shù)較為完善，并且適用于酯化和轉(zhuǎn)酯化反應，必定是將來辣椒素酯類物質(zhì)研究的發(fā)展方向。

基于辣椒素酯類物質(zhì)不僅具有多種生物活性而且沒有辛辣味和細胞毒性，其可能是食品和藥品理想的添加劑。目前辣椒素酯類物質(zhì)的應用面較廣，需求量與日劇增，目前是一種供不應求的存在狀態(tài)。因此，有關(guān)辣椒素酯類物質(zhì)的研究與開發(fā)，產(chǎn)品的實際應用與生產(chǎn)的工業(yè)化等方面的研究將具有較大的發(fā)展前景和深遠的研究意義。

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