賀宗毅，吳天祥*，徐曉寶

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

灰樹花(Grifola frondosa)，又名栗子蘑、栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、甜瓜板、舞茸等。它屬于真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌屬(Polyporus)的一種大型真菌?；覙浠ㄊ且环N富含多糖、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、無機鹽等有效成分的藥、食兩用菌。灰樹花性平味甘在藥用價值方面可用來治療小便不利、水腫、腳氣、肝硬化、腹水、糖尿病及高血壓、肥胖等疾病。近年來的研究表明，灰樹花中富含的多糖物質(zhì)具有明顯的抗誘變、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、抗HIV、保肝護肝等生理活性作用[1-5]。

天麻(Gastrodia tuber)為蘭科多年生寄生菌植物，以蜜環(huán)菌的菌絲或菌絲分泌物為營養(yǎng)來源。天麻主要產(chǎn)于四川、云南、貴州，其干燥塊莖富含天麻素，可以入藥，具有平肝、息風(fēng)、止痙作用，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等癥。天麻的主要成分包括天麻素(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)、對羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol)、香草醇(vanillyl alcohol)、香蘭素(vanillin)等。其中，天麻素是其主要活性成分[6]。許多中草藥需要與真菌共生才能生長，如天麻就必須與真菌蜜環(huán)菌共生，在傳統(tǒng)中藥炮制過程中早已有用真菌發(fā)酵中藥的方法。而近年來，在中藥炮制新技術(shù)發(fā)展中已有許多學(xué)者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)的新思路，他們認為以藥用真菌發(fā)酵中草藥可以顯著增強其免疫活性，并命名為：“雙向發(fā)酵”。劉高強等[7]在2007年報道了，中藥中華地鱉蟲和蜣螂蟲的提取物能刺激靈芝菌體生長和增加靈芝多糖的產(chǎn)量，同時他們還說明了并不清楚是中藥中的何種成分刺激了靈芝多糖的生產(chǎn)。Liu Gaoqiang等[8]又在2011年報道蜣螂蟲的提取物在一定濃度下能夠刺激靈芝的生長和靈芝三萜類化合物的生產(chǎn)，不過他們同樣還是沒有說明中藥成分和靈芝在深層發(fā)酵過程中是如何相互作用的。雖然目前對于微生物發(fā)酵中藥后，明顯提高其藥用價值已有諸多報道，但是對中藥成分與藥用真菌生長代謝間相互作用過程，缺乏深入、系統(tǒng)的研究。

近幾年研究表明向真菌培養(yǎng)基中添加適量的中藥可以促進真菌的生長或提高活性產(chǎn)物的產(chǎn)量[9-10]。Kim等[11]在2010年報道了中藥成分添加進真菌培養(yǎng)基的研究中，以中藥牛蒡子提取物和灰樹花作為研究對象，發(fā)現(xiàn)灰樹花分泌的酶能夠?qū)⑴］蜃榆辙D(zhuǎn)化為牛蒡子苷元，并且加入了牛蒡子提取物的灰樹花發(fā)酵液成分(包括灰樹花胞外多糖)有抗氧化活性。這些研究都是真菌對于中藥成分的利用情況，但是加入的中藥成分對真菌代謝產(chǎn)物的合成途徑是否有無影響，針對這個問題，本研究從灰樹花代謝途徑入手分析了天麻對灰樹花胞外多糖合成的影響。

Looijesteijn等[12]在1999年報道了，α-葡糖磷酸變位酶(α-PGM)參與了胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)的合成，而葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)則與乳酸的代謝有關(guān)，這兩種酶是糖酵解途徑(EMP)與EPS合成途徑的重要分支點。而葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)是這兩種酶的共同前體。α-PGM的活力決定了G-6-P是更多的走向多糖合成路徑還是糖酵解途徑。而在糖酵解途徑中，PGI的活力決定了G-6-P能否更多的轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(F-6-P)。據(jù)此，在灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)液中加入天麻，通過檢測灰樹花代謝過程中關(guān)鍵酶酶活力的變化，初步研究了天麻與灰樹花代謝的相互影響。由于灰樹花多糖具有明顯的抗誘變、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、保肝護肝等生理活性作用，了解天麻成分對灰樹花多糖產(chǎn)量提高的機理對指導(dǎo)灰樹花多糖類新藥制劑的研發(fā)具有重要的意義，并且藥食兩用真菌灰樹花通過轉(zhuǎn)化天麻中的有效成分，有可能獲得藥用活性更強、更穩(wěn)定的活性產(chǎn)物，活性產(chǎn)物的篩選工作正在進行當中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻(Gastrodia tuber) 貴州省德江縣天麻基地。

灰樹花菌株(51616) 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；天麻素標品 貴州迪大科技生物有限公司；葡萄糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨 上海盛思生化科技有限公司；KH2PO4天津市福晨化學(xué)試劑廠；MgSO4·7H2O 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；無水乙醇 成都金山化學(xué)試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADP)、磷酸鹽緩沖液(TEA-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、葡糖-6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase) 美國Sigma公司；Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒、PGI、α-PGM活力定量試劑盒 貴州生物有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱、G Z X-9 0 7 0 M B E 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TG2-16G低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7502PC紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面種子培養(yǎng)

從母種試管中切取出黃豆粒大小的菌絲塊，接種于斜面中部。于25℃恒溫培養(yǎng)9d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小，接于液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃、150r/min，搖床培養(yǎng)9～11d。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按15%的接種量取液體種子進行接種，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃、150r/min搖床培養(yǎng)6～7d。

1.3.4 天麻醇提液的制備

稱取一定量的天麻，加10倍量95%乙醇浸提48h，過濾后減壓蒸餾除去乙醇。用蒸餾水定容至適當體積(天麻質(zhì)量濃度以生藥量計)。靜置24h后過濾，濾液用于添加在灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3.5 生物量測定

將發(fā)酵液離心(4000r/min，20min)，用蒸餾水沖洗菌絲濾餅兩次，再離心，菌絲在90℃電熱恒溫干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量得菌絲生物量。

1.3.6 胞外多糖產(chǎn)量測定

將100mL發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心20min，得到的濾液用3,5-二硝基水楊酸比色法測還原糖含量、苯酚-硫酸法測總糖含量。胞外多糖產(chǎn)量等于總糖含量與還原糖含量之差。

1.3.7 測定樣品的制備

分別取不同發(fā)酵時間的灰樹花發(fā)酵液于4000r/min離心15min，得到的菌絲體置于冷凍后的研磨中(研磨置于冰槽內(nèi))，加入裂解液，混勻，研磨充分后轉(zhuǎn)入5mL離心管中，加入強化液，渦旋振蕩15s，反復(fù)振蕩5次后，再加入適量裂解液于離心管中，于4℃、15000r/min離心15min。離心完成后取上清液至預(yù)冷的新的5mL離心管中。制得的上清液樣品用于后續(xù)測定。

1.3.8 α-PGM和PGI酶活力的檢測

蛋白含量的測定方法為Bradford法[13]，以牛血清白蛋白制標準蛋白曲線。

α-PGM反應(yīng)液中含有0.1mol/L TEA-HCl(pH7.6)、1.98mmol EDTA、0.127mmol β-NADP、5mmol MgCl2、1U葡糖-6-磷酸脫氫酶和一定量的細胞提取物。添加1.06mmol α-葡糖-1-磷酸后反應(yīng)開始。葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)反應(yīng)液中含有0.1mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2)、5mmol MgCl2、0.127mmol β-NADP、1U葡糖-6-磷酸脫氫酶和一定量的細胞提取物。添加1.06mmol果糖-6-磷酸后反應(yīng)開始。

α-PGM、PGI酶活力定義為每分鐘每毫克蛋白中酶轉(zhuǎn)化1μmol NADPH為一個單位，故將酶活力單位定為μmol NADPH/(min·mg)。而NADPH的變化可在340nm波長處測定其吸光度的改變來反映[14]。

兩種酶酶活力的計算公式為：

式中：A1為吸光度起始讀數(shù)；A2為吸光度終讀數(shù)；V1為反應(yīng)液總體積/mL；m為樣品稀釋倍數(shù)；V2為加入樣品體積/mL；6.22為NADPH毫摩爾吸光系數(shù)；t為反應(yīng)時間/min；ρ為樣品蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻添加量對灰樹花發(fā)酵產(chǎn)EPS和生物量的影響

圖 1 天麻添加量對灰樹花胞外多糖和菌體生物量的影響Fig.1 Effect of the amount of Rhizoma gastrodiae on EPS production and dry cell biomass

在搖瓶培養(yǎng)基中加入適量的天麻，利用灰樹花強大的分解轉(zhuǎn)化能力，對天麻中的纖維、糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)加以利用?；覙浠ㄔ谏L代謝過程中可能對天麻中的主要成分天麻素進行轉(zhuǎn)化利用，從而提高胞外多糖的產(chǎn)量。其他條件為葡萄糖30g/L、蛋白胨5.5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L。不同天麻添加量對灰樹花發(fā)酵的影響結(jié)果見圖1。天麻的添加量對灰樹花胞外多糖的產(chǎn)生具有一定的促進作用。當天麻質(zhì)量濃度為7g/L時胞外多糖產(chǎn)量及菌體生物量均達到最大值，分別為3.91g/L和8.90g/L。與對照相比，胞外多糖產(chǎn)量增加了5.1%，通過方差分析顯著性P=0.0262，說明了灰樹花胞外多糖產(chǎn)量的顯著增加。而天麻經(jīng)過醇提，可以排除天麻中多糖對本實驗帶來的干擾。隨著天麻質(zhì)量濃度的升高，灰樹花菌體生物量隨之降低?？赡苁翘炻橹械哪承┏煞謱覙浠ňz的生長產(chǎn)生了抑制作用。因此確定選擇添加天麻質(zhì)量濃度為7g/L為最佳。

2.2 天麻對灰樹花胞外多糖合成的影響

采用真菌-酵母磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、真菌-酵母磷酸葡萄糖變位酶活性光譜法定量檢測試劑盒分別測定磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖變位酶的酶活性，結(jié)果見圖2。

圖 2 PGI與α-PGM酶活力的動力學(xué)曲線Fig.2 Time course of α-phosphoglucomutase (α-PGM) and phosphoglucose isomerase (PGI) activities during fermentation in the presence of Rhizoma Gastrodiae

由圖2可知，未添加天麻的灰樹花發(fā)酵組(對照組)的異構(gòu)酶活力隨發(fā)酵時間的延長其活力逐漸上升，在發(fā)酵144h時其活力達到最大值，之后隨著時間的延長其活力逐漸下降。添加天麻的灰樹花發(fā)酵組(天麻組)的異構(gòu)酶活力在144h處達到最大值，90～162h范圍內(nèi)變化不大，說明異構(gòu)酶活力在90h后與對照組相比受到一定的抑制。

總體上考察，天麻組異構(gòu)酶活力比對照組的低，天麻對異構(gòu)酶活力影響顯著(P＜0.05)，這可能是加入天麻醇提液后，醇提液中的天麻素主要成分或復(fù)合成分對灰樹花多糖合成代謝途徑中的糖酵解重要酶——PGI起抑制作用。對照組與天麻組的變位酶酶活力先均呈上升趨勢，隨后逐漸下降。兩者相比并無顯著差異(P＞0.05)，加入的天麻醇提液對變位酶并無顯著影響。這與Tang Yajie等[15]在靈芝胞外多糖合成相關(guān)酶活力研究中的結(jié)果相似。

3 討 論

目前提高灰樹花多糖產(chǎn)量的研究主要集中在灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及向培養(yǎng)基中添加適量的中藥。這些傳統(tǒng)的方法對提高灰樹花菌絲量和代謝產(chǎn)物是可行的，但本研究從另外的角度研究了中藥天麻對灰樹花胞外多糖合成的影響。

PGI是糖酵解途徑中的重要酶，其最終引導(dǎo)乳酸的生成；α-PGM是EPS合成相關(guān)的重要酶，它引導(dǎo)葡萄糖-6-磷酸向多糖合成代謝途徑方向進行。Degeest等[16]的研究表明在嗜熱鏈球菌中PGM的活力與EPS的合成緊密相關(guān)。本研究在添加天麻的基礎(chǔ)上(與對照組相比)對PGM的酶活力分析可知灰樹花EPS的合成與PGM的酶活力可能存在一種正相關(guān)的關(guān)系。天麻組的GPI活力受到顯著抑制，即糖酵解途徑受到顯著抑制，這對于葡萄糖-6-磷酸向多糖合成途徑行進是有利的。Tang Yajie等[15]在靈芝胞外多糖合成相關(guān)酶活力研究中表明采用乳糖流加法可以促進靈芝EPS的產(chǎn)生，其代謝途徑中α-PGM活力提高(與對照組相比)，PGI活力下降(與對照組相比)，其研究還表明α-PGM活力與EPS的合成正相關(guān)。正如先前的報道[17]，并聯(lián)系前面提到的α-PGM酶活力的變化情況，PGI活力的提高能減少糖異生途徑(EPS合成途徑)的碳通量，不利于EPS合成。

綜合上述表明加入適量的天麻對灰樹花胞外多糖產(chǎn)量的提高具有促進作用，天麻對PGI和PGM的影響機理如何，有待進一步研究。對于高等真菌灰樹花在EPS合成與酶的關(guān)系上并沒有相關(guān)文獻報道，希望本研究對進一步研究EPS合成的規(guī)則及產(chǎn)量的提高有所幫助。

[1] 鄧超, 鄔敏辰. 食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(15)： 4622-4625.

[2] 周鵬, 謝明勇. 多糖的生物活性[J]. 食品研究與開發(fā), 2001, 22(2)： 6-8.

[3] 陳士良. 藥用真菌灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及其抗腫瘤多糖的研究[D]. 無錫： 江南大學(xué), 2000.

[4] NANBA H. Antitumor activity of oral administered “D-Fraction” from maitake mushroom(Grifola frondosa)[J]. J Nat Med, 1993, 1(4)： 10-15.

[5] ADACHI Y, OHNO N, YADOMAE T. Activation of kupffer cells by adminis-tration with gel-forming(1,3)-β-D-glucan from Grifola frondosa[J]. Bio & Pharm Bull, 1998, 21(3)： 278-283.

[6] LIU C L, LIU M C, ZHU P L.Determination of gastrodin, p-hydroxybenzyl alcohol, vanillyl alcohol, p-hydroxylbenzaldehyde and vanillin in tall gastrodia tuber by high-performance liquid chromatography[J]. Chromatographia, 2002, 55： 317-320.

[7] LIU Gaoqiang, ZHANG Kechang. Enhancement of polysaccharides production in Ganoderma lucidum by the addition of ethyl acetate extracts from Eupolyphaga fineness and Catharsius molossus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74： 572-577.

[8] LIU Gaoqiang, XIAO Huaxi, WANG Xiaoling, et al. Stimulated production of triterpenoids of Ganoderma lucidum by an ether extract from the medicinal insect, Catharsius molossus, and identification of the key stimulating active components[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 165： 87-97.

[9] 楊海龍, 吳天祥, 章克昌. 中藥提取液對靈芝深層發(fā)酵的影響[J]. 微生物學(xué)報, 2003, 21(4)： 519-522.

[10] 王興紅, 李旗德, 曹秋娥. 微生物發(fā)酵中藥應(yīng)成為中藥研究的新內(nèi)容[J]. 中草藥, 2001, 32(3)： 267-268.

[11] KIM J H, BAE J T, SONG M H, et al. Biological activities of fructus arctii fermented with the basidiomycete Grifola frondosa[J]. Arch Pharm Res, 2010, 33(12)： 1943-1951.

[12] LOOIJESTEIJN P J, BOELS I C, KLEEREBEZEM M, et al. Regulation of exopolysaccharide production by Lactococcus lactis subsp. cremoris by the sugar source[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65： 5003-5008.

[13] 王福榮. 生物工程分析與檢驗[M]. 北京： 中國輕工業(yè)出版社, 2006.

[14] QIAN N Y, STANLEY G A. Purification and characterization of two phosphoglucomutases from Lactococcus lactis subsp. lactis and their regulation in maltose- and glucose-utilizing cells[J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(17)： 5304-5311.

[15] TANG Yajie, ZHONG Jiangjiang. Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor[J]. Biotechnology Letters, 2002, 24： 1023-1026.

[16] DEGEEST B, de VUYST L. Correlation of activities of the enzymes α-phosphogluco-mutase, UDP-galactose 4-epimerase, and UDPglucose pyrophosphorylase with exopolysa-ccharide biosynthesis by Streptococcus thermophilus LY03[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66： 3519-3527.

[17] RUNGRASSAMEE W, LIU X. Activation of glucose transport under oxidative stress in Escherichia coli[J]. Arch Microbiol, 2008, 190： 41-49.