侯小剛，劉書(shū)亮,*，韓新鋒，吳聰明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

沙門氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的一種常見(jiàn)的人畜共患病原菌，血清型有2463個(gè)，我國(guó)共檢出287個(gè)[1]。由于環(huán)境和宿主的不同，其血清型呈明顯的地域性差異[2-6]。

近年來(lái)，沙門氏菌大規(guī)模污染食品并引起食物中毒的事件時(shí)有發(fā)生[7-8]。動(dòng)物性食品是沙門氏菌污染的主要對(duì)象，動(dòng)物生前以及后續(xù)的屠宰加工、運(yùn)輸、貯藏和銷售等環(huán)節(jié)都容易污染和傳播沙門氏菌。豬肉是我國(guó)廣大居民的主要?jiǎng)游镄允称分?，?shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈(包括養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和銷售市場(chǎng))中沙門氏菌的污染和傳播情況對(duì)確保豬肉安全具有重要意義。目前，對(duì)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈單個(gè)環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染的調(diào)查已有較多報(bào)道[2,4,9]，但從豬肉產(chǎn)業(yè)鏈的整體角度，對(duì)沙門氏菌污染的調(diào)查報(bào)道較少。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度差，而PCR方法以其快速靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)中，其中，針對(duì)invA基因[10]和hut基因[11]作為靶基因的PCR方法檢測(cè)沙門氏菌已得到普遍認(rèn)可[12-15]。

本研究旨在對(duì)四川省部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈主要環(huán)節(jié)中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定和血清型分析，了解優(yōu)勢(shì)血清型的分布與傳播，為豬肉安全生產(chǎn)和沙門氏菌食物中毒的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2010—2011年期間，自四川部分地區(qū)的大型養(yǎng)豬場(chǎng)、下游生豬屠宰場(chǎng)和肉類市場(chǎng)采集樣品，其中養(yǎng)殖場(chǎng)取育肥豬糞便樣、屠宰場(chǎng)取豬胴體分割肉樣、肉類市場(chǎng)購(gòu)買零售肉樣。

氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、膽硫乳(DHL)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯均 杭州微生物有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉) 鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；DL 2000 DNA Marker、PCR反應(yīng)試劑 寶生物工程(大連)有限公司；GoldviewTM核酸染料 天根生化科技有限公司；沙門氏菌屬診斷血清(60種) 寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；其余試劑為分析純或生化試劑。

1.2 參考菌株

腸炎沙門氏菌CICC21482為陽(yáng)性對(duì)照菌株，大腸桿菌ATCC25922為陰性對(duì)照菌株，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物

根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]針對(duì)沙門氏菌invA基因和hut基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表 1 靶基因名稱及引物序列Table 1 Target gene and primer sequences

1.4 儀器與設(shè)備

Scientz-04無(wú)菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Sorvall離心機(jī) 美國(guó)科俊儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.5 方法

1.5.1 樣品采集

在豬肉生產(chǎn)加工銷售的3個(gè)主要環(huán)節(jié)(即養(yǎng)殖-屠宰加工-銷售)分別取樣。養(yǎng)豬場(chǎng)，隨機(jī)采集育肥豬肛拭糞樣置于無(wú)菌運(yùn)送培養(yǎng)基中；生豬屠宰場(chǎng)，隨機(jī)抽取胴體分割車間肉樣，每份250g左右裝到無(wú)菌保鮮袋內(nèi)；豬肉市場(chǎng)，各攤販點(diǎn)購(gòu)買零售豬肉，每份250g左右裝到無(wú)菌保鮮袋內(nèi)。所有樣品均低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，待檢。

1.5.2 沙門氏菌的分離

無(wú)菌條件下，將肛拭糞樣約1g分別置于10mL無(wú)菌MM增菌液和SC增菌液中混勻，分別在42℃(MM增菌液)和37℃(SC增菌液)條件下培養(yǎng)18～24h；將豬肉樣品放在一次性無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)用均質(zhì)器拍打成勻漿，取25g加入225mL無(wú)菌水，充分混勻10min，各取1mL浸洗液分別接種于10mL MM增菌液和SC增菌液中混勻，然后分別在42℃(MM增菌液)和37℃(SC增菌液)條件下培養(yǎng)18～24h。將增菌培養(yǎng)液劃線接種于DHL瓊脂平板和沙門氏菌顯色(法國(guó)科瑪嘉)平板進(jìn)行分離純化，篩選出疑似沙門氏菌菌株。

1.5.3 沙門氏菌分離株的二重PCR鑒定

1.5.3.1 細(xì)菌DNA的提取

采用熱裂解法[15-16]提取細(xì)菌DNA：平板上挑取單個(gè)疑似沙門氏菌菌落接種于5mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)18～20h，取培養(yǎng)液1.5mL，10000r/min離心1min，取沉淀，用1mL滅菌超純水重復(fù)洗兩次；10000r/min離心1min，取沉淀，加100μL TE(pH8.0)溶液，重懸細(xì)胞，98℃水浴10min，再于冰上放置5min；12000r/min離心1min，取上清液，即為細(xì)菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[12]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩對(duì)引物invA與hut濃度比例為1：3，PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl2(25mmol/L)1.5μL、dNTP 2μL，invA基因和hut基因上下游引物終濃度分別是0.2μmol/L和0.6μmol/L，模板DNA 2μL，補(bǔ)雙蒸水至最終體積25μL。PCR反應(yīng)程序[16]為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，于4℃保存。

1.5.3.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，能擴(kuò)增出invA基因和hut基因特異性片段的菌株，即為沙門氏菌陽(yáng)性菌株[12]。

1.5.4 沙門氏菌的血清分型

參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[17]中的方法，用沙門氏菌屬診斷血清(60種)對(duì)沙門氏菌分離株進(jìn)行血清分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似沙門氏菌分離結(jié)果

829份樣品通過(guò)選擇性培養(yǎng)基篩選得到疑似沙門氏菌陽(yáng)性樣品116份。

2.2 疑似沙門氏菌的二重PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

采用參考菌株和空白實(shí)驗(yàn)對(duì)所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明腸炎沙門氏菌CICC21482擴(kuò)增出兩條目的片段，其余對(duì)照均未擴(kuò)增出任一目的片段，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物特異性可靠。

從不同樣品中檢出的116株疑似沙門氏菌的二重PCR產(chǎn)物的部分電泳結(jié)果如圖1所示。同時(shí)擴(kuò)增出invA基因和hut基因的特異性片段(284bp和495bp)的疑似菌株(如圖1中條帶1～5、8～12)共有112株，判斷為沙門氏菌陽(yáng)性[12]，其余4株疑似沙門氏菌均未擴(kuò)增出任一目的片段(如圖1中條帶6、7)，判斷為沙門氏菌陰性。由此得出，所采集的樣品有112份呈沙門氏菌陽(yáng)性。

圖 1 部分疑似沙門氏菌二重PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoresis of duplex PCR amplified products from suspected Salmonella

2.3 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染情況

表 2 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染率Table 2 Percentage of Salmonella contimination from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染情況見(jiàn)表2。養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬沙門氏菌污染率最高，達(dá)到16.40%(71/433)，而生豬屠宰場(chǎng)和豬肉市場(chǎng)的豬肉樣品沙門氏菌污染率分別是10.71%(21/196)和10.00%(20/200)。

2.4 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的血清型分布情況

112株沙門氏菌的血清鑒定結(jié)果見(jiàn)表3，共有102株沙門氏菌被定型，可分為11種血清型；另有10株未定型沙門氏菌菌株不自凝，且均與沙門氏菌屬診斷血清O多價(jià)(A～F)呈陽(yáng)性反應(yīng)，具體血清型種類還有待采用更多的血清因子進(jìn)一步確定。已定型的沙門氏菌：德?tīng)柋吧抽T氏菌占58.04%(65/112)，鼠傷寒沙門氏菌占12.50%(14/112)，波茨坦沙門氏菌占6.25%(7/112)，其余血清型占少數(shù)。養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬中檢出的沙門氏菌共分為7種血清型，其中德?tīng)柋吧抽T氏菌占63.38%(45/71)，鼠傷寒沙門氏菌占16.90%(12/71)，波茨坦沙門氏菌占5.63%(4/71)，其余血清型占少數(shù)；生豬屠宰場(chǎng)豬肉中檢出的沙門氏菌共分為4種血清型，其中德?tīng)柋吧抽T氏菌占61.90%(13/21)，鼠傷寒沙門氏菌和吉韋沙門氏菌各占9.52%(2/21)，茨昂威沙門氏菌占4.76%(1/21)，另有3株未分型；銷售市場(chǎng)豬肉中檢出沙門氏菌共有6種血清型，其中德?tīng)柋吧抽T氏菌占35.00%(7/20)，波茨坦沙門氏菌和吉韋沙門氏菌各占15.00%(3/20)，圣保羅沙門氏菌和豬霍亂或丙型副傷寒沙門氏菌各占10.00%(2/20)，鴨沙門氏菌占5.00%(1/20)，另有兩株未分型。

表 3 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的血清型分布情況Table 3 Serotype distribution of Salmonella from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

2.5 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清群的分布情況

表 4 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清群的分布Table 4 Serogroup distribution of Salmonella from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

由表4可知，四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清型分布在B、C、E群，而產(chǎn)業(yè)鏈各個(gè)環(huán)節(jié)沙門氏菌都以B群為優(yōu)勢(shì)血清群，但是在市場(chǎng)豬肉中，B群沙門氏菌所占的比例(9/18)明顯低于養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬和屠宰場(chǎng)豬肉中B群沙門氏菌所占的比例(58/66、15/18)。

3 討 論

目前，沙門氏菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法、PCR方法和免疫學(xué)方法。免疫學(xué)方法雖然準(zhǔn)確，但成本較高、靈敏度較低；傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣，難以應(yīng)對(duì)大規(guī)模樣品中沙門氏菌的快速檢測(cè)[18-19]；而PCR方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。本研究檢測(cè)沙門氏菌采用的是傳統(tǒng)方法分離、PCR方法鑒定的方式，實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確從大批量樣品中收集沙門氏菌的目的。根據(jù)invA基因和hut基因設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物鑒定沙門氏菌分離株的結(jié)果與血清學(xué)結(jié)果一致，說(shuō)明這兩個(gè)特異性基因在檢測(cè)沙門氏菌時(shí)可靠，與文獻(xiàn)[12-15]等的結(jié)論相符。

從本研究的結(jié)果來(lái)看，在所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染率比較高，而不同的采樣環(huán)節(jié)污染率有一定差異。養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬沙門氏菌污染率最高，達(dá)到了16.40%，而張瑋[9]對(duì)安徽部分豬場(chǎng)生豬調(diào)查的結(jié)果表明沙門氏菌檢出率總體達(dá)到4.07%，其中安慶地區(qū)豬場(chǎng)檢出率達(dá)到18.89%，說(shuō)明不同采樣點(diǎn)生豬沙門氏菌檢出率差異明顯。屠宰場(chǎng)和銷售市場(chǎng)豬肉沙門氏菌污染率相近，分別為10.71%和10.00%，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于某些報(bào)道中的74.6%[20]，而張靜等[21]對(duì)某定點(diǎn)生豬屠宰場(chǎng)的研究中指出生豬胴體體表和肉樣沙門氏菌檢出率分別為5%和0%，席昭雁等[22]在對(duì)陜西食品的調(diào)查中指出生豬肉中沙門氏菌的檢出率達(dá)到19.10%。本研究中所采集生豬肉樣大部分來(lái)自衛(wèi)生條件不規(guī)范的屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)，其中多個(gè)環(huán)節(jié)冷鏈系統(tǒng)不夠完備，加之相關(guān)從業(yè)人員疏忽和來(lái)自環(huán)境的污染，造成了所采生肉樣品沙門氏菌的污染率較高。可見(jiàn)，在豬肉屠宰場(chǎng)和銷售市場(chǎng)，不同的衛(wèi)生條件下沙門氏菌的污染率差異很大，衛(wèi)生條件嚴(yán)格的情況下沙門氏菌污染率很低甚至可以達(dá)到零污染，衛(wèi)生條件不規(guī)范的情況下容易出現(xiàn)沙門氏菌大規(guī)模污染食品。

從本研究中沙門氏菌的血清型統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌分離株以德?tīng)柋吧抽T氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，與楊保偉等[2]的研究結(jié)果一致，而在國(guó)內(nèi)其他的相關(guān)研究報(bào)道中，有以腸炎沙門氏菌占優(yōu)勢(shì)[23]，也有以鼠傷寒沙門氏菌占優(yōu)勢(shì)[24]，表明沙門氏菌優(yōu)勢(shì)菌血清型的分布存在很大的區(qū)域性差異。本研究中德?tīng)柋吧抽T氏菌雖然在各產(chǎn)業(yè)鏈中均占優(yōu)勢(shì)，但隨著產(chǎn)業(yè)鏈條的遞進(jìn)(養(yǎng)殖場(chǎng)-屠宰場(chǎng)-銷售市場(chǎng))，優(yōu)勢(shì)血清型在各產(chǎn)業(yè)鏈條中所占比例有所下降，漸變過(guò)程為63.38%、61.90%、35.00%，與此同時(shí)在上游產(chǎn)業(yè)鏈中占劣勢(shì)的血清型到下游產(chǎn)業(yè)鏈中其比例有所上升；另外，某些在上游產(chǎn)業(yè)鏈中檢出的血清型在下游產(chǎn)業(yè)鏈中并未檢出，而有些在上游產(chǎn)業(yè)鏈中并未檢出的血清型卻出現(xiàn)在下游產(chǎn)業(yè)鏈中。說(shuō)明沙門氏菌在本研究所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中主要以垂直傳播的途徑污染生豬，即多數(shù)沙門氏菌來(lái)源于生豬本身，同時(shí)在產(chǎn)業(yè)鏈下游環(huán)節(jié)中外源性沙門氏菌又進(jìn)一步污染生豬肉。

四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌污染情況不容樂(lè)觀，并且產(chǎn)業(yè)鏈上游環(huán)節(jié)中沙門氏菌向產(chǎn)業(yè)鏈下游環(huán)節(jié)垂直傳播；生豬屠宰場(chǎng)和銷售市場(chǎng)衛(wèi)生規(guī)范執(zhí)行不嚴(yán)格，導(dǎo)致加工、銷售中的生豬肉再次感染沙門氏菌。因此，需要政府及相關(guān)部門加強(qiáng)對(duì)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈的生產(chǎn)衛(wèi)生監(jiān)督，確保衛(wèi)生措施有效執(zhí)行。

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