張?zhí)N慧，李運(yùn)倫，閆 濱，李寶國(guó)，齊冬梅，曲政軍，張思碩

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250011； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

高血壓病又稱原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH），是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，是心腦血管事件的主要促危因素，是致殘與死亡的重要誘因［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝腎失調(diào)是高血壓病的主要發(fā)病機(jī)理，肝陽(yáng)上亢證和陰陽(yáng)兩虛證是高血壓病中最常見(jiàn)的證型［2］。本課題采用毛細(xì)管電泳技術(shù)測(cè)定高血壓肝陽(yáng)上亢證和陰陽(yáng)兩虛證的去甲腎上腺素含量，尋找中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)信息，探索出中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究的新方法與新途徑。

1 臨床資料

根據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南（2010年版）》的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］和中醫(yī)肝陽(yáng)上亢證和陰陽(yáng)兩虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)［4］，從國(guó)家高血壓中醫(yī)臨床研究基地門診、病房以及附屬示范社區(qū)，選擇經(jīng)過(guò)2 w“洗脫期”后舒張壓在90 mm Hg～109 mm Hg的2級(jí)高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者21例、高血壓陰陽(yáng)兩虛證患者12例和健康志愿者13例，3組均知情同意、自愿受試，在年齡、性別分布方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。均清晨取空腹靜脈血，不抗凝，離心取血清，置-80℃冰箱保存。

2 方法

2.1 試劑和儀器

Agilent高效毛細(xì)管電泳儀，75 μm聚丙烯酰胺毛細(xì)管柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，甲醇、乙腈（色譜純），硼砂、去甲腎上腺素（購(gòu)自Sigma公司），其余試劑為分析純。

2.2 血清樣品預(yù)處理

采用如下方法，分別考察不同溶劑、沉淀劑種類對(duì)去甲腎上腺素測(cè)定的影響。方法1：精密移取血清0.4 mL于試管中，加入甲醇0.8 mL，震蕩混勻，離心（4 000 r/min），取上清液作為供試品溶液。方法2：精密移取血清0.4 mL于試管中，加入甲醇0.8 mL，震蕩混勻，離心（4 000 r/min），取上清液，旋蒸至近干，緩沖鹽溶解0.6 mL，作為供試品溶液。方法3：精密移取血清0.4 mL于試管中，加入乙腈0.8 mL，震蕩混勻，離心（4 000 r/min），取上清液，旋蒸至近干，緩沖鹽溶解0.6 mL，作為供試品溶液。方法4：精密移取血清0.4 mL于試管中，加入高氯酸0.8 mL，震蕩混勻，離心（4 000 r/min），取上清液，旋蒸至近干，緩沖鹽溶解0.6 mL，作為供試品溶液。

2.3 高效毛細(xì)管電泳條件

電壓 20 kV，柱長(zhǎng) 50 cm，電流上限 100 μA，分析時(shí)間30 min，壓力20 kPa進(jìn)樣8 s，檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm、230 nm、254 nm、280 nm、326 nm。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別采取 200 nm、230 nm、254 nm、280 nm、326 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行分析。從色譜行為看，230 nm最優(yōu)，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 空白實(shí)驗(yàn)

分別取空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，行毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果顯示樣品測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 血清預(yù)處理方法選擇

4種不同處理方法，經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，緩沖鹽配置溶液分析優(yōu)于直接進(jìn)樣。甲醇處理后，色譜峰多于乙腈及高氯酸處理的樣品，故確定為方法2。

3.4 緩沖鹽濃度的選擇

選擇不同緩沖鹽體系，包括磷酸二氫鈉和磷酸的磷酸鹽體系、硼砂體系、含有氯化鈉的體系。經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，確定硼砂體系，分別對(duì)10 mmol、20 mmol、30 mmol的硼砂進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)硼砂濃度為20 mmol時(shí)，分離電流及分離度均合適。

3.5 線性范圍考察

精密稱取干燥至恒重的去甲腎上腺素對(duì)照品加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，分別取吸 0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，加緩沖鹽溶液稀釋至1 mL，經(jīng)毛細(xì)管電泳分析測(cè)定，以去甲腎上腺素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得一直線，求回歸方程為y=187.94x+4.40，r=0.996 1，表明去甲腎上腺素在 5 μg/mL～50 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

表1 去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

3.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，用上述方法測(cè)定，RSD=3.01%，表明儀器精密度良好。

圖2 去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按上述條件分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 測(cè)定去甲腎上腺素的含量，RSD=3.24%，表明樣品在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份血清樣品，按方法2制備供試品，測(cè)定供試品去甲腎上腺素含量，RSD=2.42%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

0.2 mL樣本血清中準(zhǔn)確加入定量的10 μg/mL去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照樣品處理方法操作，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所測(cè)得的濃度，以下面方法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

其中y代表回收率，m1代表實(shí)際測(cè)得去甲腎上腺素含量，m2代表供試品中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，m代表加入對(duì)照品的量。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.10 樣品測(cè)定結(jié)果

取健康志愿組、高血壓病肝陽(yáng)上亢組和高血壓病陰陽(yáng)兩虛組血樣，制備供試品溶液，行毛細(xì)管電泳分析，以峰面積計(jì)算血清中去甲腎上腺素的含量。3組血清中去甲腎上腺素（NE）含量的比較，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，高血壓肝陽(yáng)上亢組和健康志愿組相比以及高血壓病陰陽(yáng)兩虛組與高血壓病肝陽(yáng)上亢組相比，去甲腎上腺素含量均有明顯差異，高血壓病的兩個(gè)中醫(yī)證型的NE含量均高于健康志愿組，而高血壓病陰陽(yáng)兩虛證血清中NE含量低于高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者。

表3 3組血清中去甲腎上腺素（NE）含量的比較 （pg/mL，s）

表3 3組血清中去甲腎上腺素（NE）含量的比較 （pg/mL，s）

注：與健康志愿組比較，1）P＜0.05；與高血壓病肝陽(yáng)上亢組比較，2）P＜0.05

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4 討論

高血壓病屬中醫(yī)“眩暈”、“頭痛”和“肝風(fēng)”等疾病的范疇，肝陽(yáng)上亢證和陰陽(yáng)兩虛證是其常見(jiàn)的證候類型，均具有特征的外象與內(nèi)涵?！巴庀蟆敝缸C候的表征，亦即癥狀和體征的組合，高血壓病肝陽(yáng)上亢證與陰陽(yáng)兩虛證雖以陰液虛損為共同病理環(huán)節(jié)，但是由于陽(yáng)氣功能狀態(tài)不同，兩者在外則表現(xiàn)為不同的癥狀和體征組合。高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者除見(jiàn)頭痛、眩暈、腰膝酸軟、心悸、耳鳴、健忘外，還見(jiàn)急躁易怒、失眠多夢(mèng)、面赤、口苦口干等陽(yáng)亢的表現(xiàn)，陰陽(yáng)兩虛證還見(jiàn)畏寒肢冷、氣短乏力、夜尿頻、小便清長(zhǎng)等陽(yáng)虛的表現(xiàn)，這是兩個(gè)證候表征的主要異同點(diǎn)?！皟?nèi)涵”指在結(jié)構(gòu)、代謝、功能諸方面的物質(zhì)基礎(chǔ)。遵循中醫(yī)學(xué)“有諸內(nèi)必形之于外”的理論軌跡，高血壓病肝陽(yáng)上亢證與陰陽(yáng)兩虛證之所以存在證候表征的外在差異，其根本原因在于二者存在不同的代謝模式。本研究借鑒代謝組學(xué)的研究思路，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)高血壓病肝陽(yáng)上亢證與高血壓病陰陽(yáng)兩虛證患者作血液代謝輪廓分析，冀以發(fā)現(xiàn)與該病證密切相關(guān)的特定代謝組分及生物標(biāo)記物。

高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者陽(yáng)氣功能相對(duì)旺盛，氣血尚未衰敗，臟腑功能相對(duì)亢進(jìn)，多伴有交感神經(jīng)活性增強(qiáng)［5］；而高血壓病陰陽(yáng)兩虛證患者多由于陽(yáng)氣功能衰敗，氣血俱虛，導(dǎo)致臟器功能低下，機(jī)體代謝率減緩［6］。本研究表明，高血壓病患者血清NE含量較健康志愿者組為高，高血壓病肝陽(yáng)上亢證為本虛標(biāo)實(shí)證，故交感神經(jīng)系統(tǒng)活性相對(duì)亢進(jìn)；陰陽(yáng)兩虛證為純虛無(wú)實(shí)證，故交感神經(jīng)系統(tǒng)活性相對(duì)不足。因此，血液NE的含量變化可作為高血壓病中醫(yī)虛實(shí)辨證的客觀化指標(biāo)，血液NE含量的變化可反映高血壓病由陰虛陽(yáng)亢向陰陽(yáng)兩虛轉(zhuǎn)化的本質(zhì)。

相對(duì)于高效液相色譜和氣相色譜技術(shù)，毛細(xì)管電泳技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：所需樣品量少、儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便；分析速度快，分離效率高，分辨率高，靈敏度高；操作模式多，開(kāi)發(fā)分析方法容易；實(shí)驗(yàn)成本低，消耗少；應(yīng)用范圍極廣［7-8］。近年來(lái)毛細(xì)管電泳（CE）因其高效、低耗、簡(jiǎn)便、樣本消耗少等特點(diǎn)成為多組分代謝輪廓分析的流行方法，但由于其光程短和上樣量少，經(jīng)常為靈敏度不足和重現(xiàn)性差所困擾。本課題研究利用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)生物體系中的代謝物輪廓分析，測(cè)定血液中去甲腎上腺素含量，分離專屬性強(qiáng)，可以揭示血液去甲腎上腺素與高血壓病肝陽(yáng)上亢證與陰陽(yáng)兩虛證的關(guān)系，有利于深入認(rèn)識(shí)和理解高血壓病肝陽(yáng)上亢證的本質(zhì)，同時(shí)為中醫(yī)臨床診斷、治療提供了新的思路，為中醫(yī)證候本質(zhì)探討提出了新的方法和手段。僅采用毛細(xì)管電泳技術(shù)分析人體體液樣品，檢測(cè)方式具有單一性，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振檢測(cè)，以全面確定代謝標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)證候“整體性”的代謝產(chǎn)物客觀表征。

［1］賀立娟，李運(yùn)倫.高血壓病肝陽(yáng)上亢證中醫(yī)病機(jī)與證候?qū)嵸|(zhì)的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2008，6（12）：1 449-1 451.

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