陳貴海，鄧 巍，臧知明，蔣 筱，王進(jìn)聲

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001； 2.河南省開封市第二中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開封475000）

肥胖患者脂肪因子分泌失調(diào)，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂、免疫改變，引起血管收縮、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血液凝固等，參與了代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。血瘀證與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂、血管活性物質(zhì)比例失調(diào)等多種因素有關(guān)，肥胖患者血瘀證的形成與體質(zhì)量指數(shù)、體脂和糖脂代謝有關(guān)［1-2］。為探討脂肪組織與血管活性因子之間的聯(lián)系，采用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型大鼠脂肪組織、血清中內(nèi)臟脂肪素等脂肪因子含量，探討其與糖脂代謝的關(guān)系以及活血化瘀藥物對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重（180±20）g，由湖南省長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK湘20060001。

1.1.2 藥物與試劑 血府逐瘀湯：柴胡3 g，赤芍6 g，枳殼 6 g，炙甘草 6 g，桃仁 12 g，生地 9 g，當(dāng)歸 9 g，川芎4.5 g，桔梗4.5 g，川牛膝9 g，紅花9 g。血府逐瘀合二陳湯：柴胡3 g，赤芍6 g，枳殼6 g，炙甘草6 g，桃仁 12 g，生地 9 g，當(dāng)歸 9 g，川芎 4.5 g，桔梗 4.5 g，川牛膝 9 g，紅花 9 g，橘紅 15 g，法半夏 15 g，茯苓 9 g，烏梅1個(gè)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯：生黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g。中藥購(gòu)于廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院仁愛(ài)分院。各中藥水煎濃縮成含生藥120%的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。大鼠?nèi)臟脂肪素（內(nèi)脂素、Visfatin）Elisa試劑盒由上海百沃生物科技有限公司生產(chǎn)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由海門市碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)、南寧天地?fù)P生物技術(shù)有限公司提供。血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇生化試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)，低密度脂蛋白膽固醇生化試劑盒由北京北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)，游離脂肪酸生化試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)、南寧博仁生物科技有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TY-201電動(dòng)高速勻漿器，江蘇新海實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；SIM-F124制冰機(jī)，日本三洋電器公司；202AS電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BR4I電熱恒溫水浴箱，上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠；-80℃超低溫冰箱，青島海爾集團(tuán)公司；TL-2000MM-1微孔板振蕩器，江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；5810R 超低溫離心機(jī)，Eppendorf；Multiscan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀，德國(guó)Thermo公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 根據(jù)文獻(xiàn)［3］報(bào)道的方法，以高脂飼料復(fù)制營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型。飼料配方：于每100 g基礎(chǔ)飼料中加入豬油5 g，雞蛋30 g，奶粉30 g，白糖10 g，黃豆10 g，魚肝油10滴為高脂飼料，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 60只大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫18℃~25℃，明暗周期12 h/12 h，45%濕度的環(huán)境中，自由飲水。預(yù)飼養(yǎng)3 d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為 2組?？瞻捉M 10只，平均體質(zhì)量（184.6±9.6）g；造模組 50只，平均體質(zhì)量（184.7±10.3）g。空白組給予普通飼料，造模組給予高脂飼料復(fù)制肥胖模型。各組大鼠自由進(jìn)食、飲水，每周測(cè)體質(zhì)量1次，連續(xù)4 w。4 w后造模組大鼠體質(zhì)量增加量超過(guò)空白組均值10%為造模成功，排除造模不成功大鼠10只。

1.2.3 動(dòng)物分組與藥物干預(yù) 將造模成功大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為模型組、活血組、補(bǔ)氣活血組和化痰活血組，每組10只。與空白組合計(jì)，共5組、50只?；钛M給予血府逐瘀湯、補(bǔ)氣活血組給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯、化痰活血組給予血府逐瘀湯合二陳湯進(jìn)行藥物干預(yù)，空白組和模型組給予生理鹽水。給藥量均以10倍成人劑量（質(zhì)量比，成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)算）稀釋成3 mL灌胃給藥，連續(xù)4 w。各組飼料不變。

1.2.4 動(dòng)物取材與標(biāo)本制作 末次給藥12 h后禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛0.3 g/kg。麻醉后腹主動(dòng)脈取血，注入試管，自凝后離心取血清。置于無(wú)菌EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取血后立即沿腹中線打開腹腔，取出腎后脂肪及肩胛間區(qū)皮下脂肪，于冰上剔去其他組織，在冰浴的生理鹽水中漂凈血液，濾紙吸干水分，分裝3份，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酶聯(lián)免疫檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取內(nèi)臟脂肪組織或皮下脂肪組織100 mg，置預(yù)冷1 mL生理鹽水的10 mL EP管中，電動(dòng)勻漿器冰浴勻漿1 min，1 000 r/mim、離心20 min，取中間層總蛋白液即為蛋白溶液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)定蛋白濃度后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測(cè)時(shí)將試劑及樣本（組織蛋白溶液、血清）在室溫下平衡30 min，4℃、3 000 r/min離心1 min后進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本、酶聯(lián)親和物等，充分混勻，37℃孵育60 min，洗板5次，加入底物Ⅰ和底物Ⅱ，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min后，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.2.6 化學(xué)法檢測(cè) 化學(xué)法檢測(cè)血清中葡萄糖（GOD-PAP法）、三酰甘油（GOD-PAP法）、游離脂肪酸（銅離子比色法）、高密度脂蛋白膽固醇（PTAMg2+沉淀法）、低密度脂蛋白膽固醇（選擇性沉淀法）、總膽固醇（COD-CE-PAP法）的濃度。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同活血化瘀藥物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

結(jié)果見表1。

表1 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠體質(zhì)量增加量影響的比較 （s）

表1 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠體質(zhì)量增加量影響的比較 （s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n 體質(zhì)量增加量（g）空白組 10 137.3±17.8模型組 10 172.5±18.51）活血組 10 158.2±17.6補(bǔ)氣活血組 10 163.1±20.1化痰活血組 10 151.8±18.32）

由表1可以看出，模型組大鼠體質(zhì)量增加量大于空白組（t=4.335 8，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，化痰活血組大鼠體質(zhì)量增加量降低（t=2.515 5，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；活血組大鼠體質(zhì)量增加量有降低趨勢(shì)（t=1.771，P=0.093 5），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)氣活血組大鼠體質(zhì)量增加量有降低趨勢(shì)（t=1.0881，P=0.290 9），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、血清的內(nèi)臟脂肪素含量的影響

結(jié)果見表2。

表2 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、血清的內(nèi)臟脂肪素含量影響的比較 （μg/L，s）

表2 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、血清的內(nèi)臟脂肪素含量影響的比較 （μg/L，s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05；與活血組比較，5）P＜0.05

組別 n 內(nèi)臟脂肪素皮下脂肪 內(nèi)臟脂肪 血清空白組 10 0.717±0.175 4.591±1.355 0.042±0.014模型組 10 0.866±0.1232） 8.248±1.6131） 0.079±0.0081）活血組 10 0.705±0.0783） 6.281±1.3463） 0.064±0.0113）補(bǔ)氣活血組 10 0.874±0.165 6.776±1.4924） 0.092±0.0144）化痰活血組 10 0.621±0.0503）5） 4.759±1.5903）5） 0.059±0.0063）

由表2可以看出，普飼大鼠內(nèi)臟脂肪的內(nèi)臟脂肪素含量顯著高于皮下脂肪，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組比較，模型組大鼠皮下脂肪內(nèi)臟脂肪素含量升高（t=2.202 8，P＜0.05）。與模型組比較，活血組（t=3.495 6，P＜0.01）、化痰活血組（t=5.835 2，P＜0.01）其含量降低，以化痰活血組降低最顯著。與活血組比較，化痰活血組其含量降低（t=2.867 0，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與空白組比較，模型大鼠內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)臟脂肪素含量升高（t=5.489 6，P＜0.01）。與模型組比較，活血組（t=5.489 6，P＜0.01）、補(bǔ)氣活血組（t=2.118 5，P＜0.05）、化痰活血組（t=4.871 3，P＜0.01）其含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與空白組比較，模型大鼠血清內(nèi)臟脂肪素濃度升高（t=7.256 3，P＜0.01）。與模型組比較，活血組（t=3.487 4，P＜0.01）、化痰活血組（t=6.324 6，P＜0.01）其濃度降低，但是補(bǔ)氣活血組（t=2.549 5，P＜0.05）其濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠血清糖脂代謝的影響

結(jié)果見表3。

表3 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠血清糖脂代謝指標(biāo)含量影響的比較（mmol/L，s）

表3 不同活血藥物對(duì)肥胖大鼠血清糖脂代謝指標(biāo)含量影響的比較（mmol/L，s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05

?

3 討論

近來(lái)對(duì)不同部位脂肪組織差異性的研究發(fā)現(xiàn)，分布于不同部位的脂肪組織在代謝及內(nèi)分泌功能方面存在明顯差異。內(nèi)臟脂肪組織的堆積易造成胰島素抵抗、糖利用障礙、脂肪分解增加，是代謝綜合征發(fā)生的關(guān)鍵因素。

內(nèi)臟脂肪素具有獨(dú)立于胰島素而又有類似胰島素的作用，2型糖尿病患者血漿內(nèi)臟脂肪素水平升高，是2型糖尿病的獨(dú)立相關(guān)因子，提示內(nèi)臟脂肪素可能在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用［4］。內(nèi)臟脂肪素主要在腹部?jī)?nèi)臟脂肪中表達(dá)，在肥胖發(fā)展過(guò)程中其血漿濃度升高，內(nèi)臟脂肪mRNA表達(dá)增加，血漿visfatin濃度與內(nèi)臟脂肪的數(shù)量有很強(qiáng)的相關(guān)性［5］，但與皮下脂肪關(guān)系不大。研究結(jié)果顯示，營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型大鼠血清內(nèi)臟脂肪素濃度升高，而且內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)臟脂肪素含量約10倍于皮下脂肪組織，表明內(nèi)臟脂肪素主要在內(nèi)臟脂肪中表達(dá)，與大多數(shù)研究結(jié)果相同。

血府逐瘀湯、血府逐瘀湯合二陳湯能夠下調(diào)血清中內(nèi)臟脂肪素含量，各活血方藥對(duì)內(nèi)臟脂肪組織和皮下脂肪組織中內(nèi)臟脂肪素含量亦有顯著調(diào)節(jié)作用。血府逐瘀湯合二陳湯對(duì)皮下脂肪組織、內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)臟脂肪素的下調(diào)作用均優(yōu)于血府逐瘀湯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明血府逐湯與二陳湯在肥胖癥治療方面可能存在協(xié)同作用。研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣活血藥物補(bǔ)陽(yáng)還五湯上調(diào)血清內(nèi)臟脂肪素濃度，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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［2］Chen Guihai，Sui Jian，Chen Liguo.Correlation between obesity and the developement of blood stasis syndrome［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（11）：206-209.

［3］孫志，張中成，劉志誠(chéng).營(yíng)養(yǎng)性肥胖動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（4）：466-467.

［4］Chen M P，Chung F M，Chang D M，et al.Elevated plasma level of visfatin/pre-Bcell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（1）：295-299.

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