趙 換 ，劉必旺 ，王永輝 ，李艷彥 ，趙俊云 ，楊向竹 ，翟志光 ，岳曉華 ，王坤芳 ，侯棟宇，朱冰清，周 然

（1.山西中醫(yī)學院，山西 太原030024； 2.北京中醫(yī)藥大學，北京100029； 3.中國中醫(yī)科學院，北京100700）

風濕寧膠囊處方來源于山西省四大名老中醫(yī)之一白清佐先生，該方由17味中藥組成。自20世紀50年代白老先生就開始應用該方治療類風濕性疾病，且療效顯著。為了開發(fā)藥味較少、療效明確的新藥，我們依據相關的中醫(yī)藥理論和實驗研究對風濕寧膠囊處方進行了拆方研究［1］，大致以6～8味中藥為一個處方，共確定了10個小處方，筆者負責五號方的研究。風濕寧膠囊五號方（簡稱：五號方）主要由羌活、獨活、青風藤、肉桂、川牛膝、三棱、川芎、甘草等組成。現(xiàn)就有關五號方鎮(zhèn)痛作用及對類風濕性關節(jié)炎（RA）炎癥細胞因子和血流變影響的實驗研究內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，體重（21±2）g，Wistar大鼠，體重（220±20）g，雌雄各半，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，許可證號SCXK（京）0089326，2009-0001和 2009-0002。

1.1.2 藥品與試劑 風濕寧五號方（簡稱：五號方）由山西仁源堂藥業(yè)有限公司制作提供。大鼠白細胞介素 1α（IL-1α）、白細胞介素 2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子 β（TNF-β）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，均購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所（批號：20090326）。

1.1.3 實驗儀器 DC-2006低溫恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SA-6000血流變檢測儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；Spectramax 190連續(xù)光譜酶標測試儀（美國分子儀器公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 五號方鎮(zhèn)痛作用［2-3］取昆明種小鼠100只，隨機分為模型組、阿司匹林組（200 mg/kg）、五號方低、中、高劑量組5組，每組20只。五號方溶解于蒸餾水中，分別配成30 g/L、60 g/L、120 g/L的溶液，分別灌胃給藥，給藥體積均為0.3 mL/10 g體重，空白組和模型組給予等容積生理鹽水，給藥后30 min，腹腔注射0.7%醋酸生理鹽水0.2 mL/只，采用小鼠冰醋酸扭體法觀察記錄小鼠扭體反應潛伏期以及10 min內的扭體次數(shù)。

1.2.2 抗炎及對血液流變學影響 采用弗氏佐劑法加低溫乙醇浸踝法。取大鼠60只，隨機分為正常對照組、模型組、阿司匹林組、五號方低、中、高劑量組6組，每組10只。類風濕性關節(jié)炎（RA）模型復制：參照文獻［4］方法。將石蠟、羊毛脂以3∶1比例混合，高壓滅菌后加入卡介苗，充分混勻，制成卡介苗濃度為8 g/L的完全弗氏佐劑（Freund complete adjuvant，CFA）；將Ⅱ型膠原（CⅡ）溶于 0.1 mol/L冰醋酸，4℃冰箱過夜，使其充分溶解，然后加入CFA混勻，制成CⅡ含量為1.5 g/L的乳劑抗原。模型組及治療組大鼠尾根部注射上述抗原0.1 mL/只，15 d后半量再次免疫，末次免疫2 w后處死，在處死的前3 d除正常對照組外，將其余各組大鼠右后足踝關節(jié)以下部位浸入 1 000 mL，-5 ℃ 40%乙醇液中 1 min 后撈出［5-6］，復制大鼠RA模型。取材作指標檢測。治療組于初次免疫當天給藥，給藥體積均為0.15 mL/10 g體重，直至處死。

末次免疫2 w后，各組大鼠用20%烏拉坦100 mg/kg體重腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血5 mL，取2 mL肝素抗凝，用SA-6000血流變檢測儀檢測全血黏度、血漿黏度、血細胞比容、紅細胞聚集指數(shù)及紅細胞變形指數(shù)等指標［5］；剩余血液3 000 r/min離心15 min，分離血清，照ELISA試劑盒說明書操作，檢測大鼠炎癥細胞因子 IL-1α、IL-2、IL-6和 TNF-β含量［6］。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 五號方對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響

結果見表1。

表1 五號方對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響 （s）

表1 五號方對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響 （s）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

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由表1可見，同模型組比較，阿司匹林組、五號方中、高劑量組小鼠扭體次數(shù)明顯減少（P<0.05，P<0.01），低劑量組效果不明顯。

2.2 風濕寧五號方對RA模型大鼠炎癥細胞因子IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-β 的影響

結果見表2。

表2 風濕寧五號方對RA模型大鼠炎癥細胞因子的影響（pg/mL，s）

表2 風濕寧五號方對RA模型大鼠炎癥細胞因子的影響（pg/mL，s）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

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從表2可以看出，與模型組相比，五號方各劑量組大鼠炎癥細胞因子都有所改善，阿司匹林組、五號方高劑量組IL-1α、IL-6、TNF-β的水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），說明風濕寧五號方對于RA模型在炎癥細胞因子方面有一定的改善作用。

2.3 風濕寧五號方對RA模型大鼠血流變的影響

與RA模型組比較，阿司匹林組、五號方各劑量組對RA模型大鼠血流變指標都有所改善，五號方中、高劑量組大鼠全血黏度（低切、高切）、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)顯著性降低（P<0.05，P<0.01），紅細胞變形指數(shù)顯著性升高（P<0.05），說明風濕寧五號方對于RA模型大鼠在血流變方面有一定的改善作用。結果見表3。

3 討論

表3 風濕寧五號方對RA模型大鼠血流變的影響 （s）

表3 風濕寧五號方對RA模型大鼠血流變的影響 （s）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

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RA是累及小關節(jié)為主的多發(fā)性對稱性關節(jié)炎，臨床上RA患者存在疼痛和血液濃、黏、聚的狀態(tài)及免疫功能失調狀態(tài)，血液中的炎癥細胞因子IL-1α、IL-2、IL-6 和 TNF-β 含量均升高［7］。前期實驗發(fā)現(xiàn)單純的弗氏佐劑法造模，只可使炎癥細胞因子改變，血流變指標改變不明顯。我們依據中醫(yī)思想“血得溫則行，得寒則凝”增加低溫乙醇浸踝法，結果顯示此種RA大鼠模型可使炎癥細胞因子和血流變指標達到實驗的要求。實驗結果表明，風濕寧五號方各組均可不同程度減少小鼠醋酸扭體次數(shù)，其中中、高劑量組抑制效應顯著，風濕寧五號方具有很好的鎮(zhèn)痛功效；各劑量組對弗氏佐劑法加低溫乙醇浸踝法的RA模型大鼠血流變指標和炎癥細胞因子都有所改善，五號方高劑量組大鼠全血黏度（低切、高切）、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)顯著性降低，紅細胞變形指數(shù)顯著升高，IL-1α、IL-6、TNF-β 的水平顯著降低，說明其治療RA的機制可能是通過鎮(zhèn)痛、改善血流變及炎癥細胞因子等途徑實現(xiàn)的。

從中醫(yī)藥理論分析，我們前期查閱文獻統(tǒng)計分析首次發(fā)現(xiàn)治療RA的用藥規(guī)律，在治療RA的中藥中，使用頻率由高至低的主要中藥類別依次是：祛風濕藥、補虛藥、活血化瘀藥、解表藥、清熱藥、平肝息風藥、利水滲濕藥；在組合藥物的統(tǒng)計結果中，補益藥、解表藥、祛風濕藥與活血化瘀藥之間的配伍占據了高頻次組合的絕大部分，說明類風濕性關節(jié)炎治療中，藥物的配伍使用是以此四類藥物為核心展開臨證處方體系。風濕寧五號方中包括了此四類藥，羌活以祛除上半身風寒濕邪，獨活祛除腰部以下風寒濕邪以止痹痛，為全方之君藥；青風藤除濕通絡止痛，川牛膝補肝腎、強筋骨，川芎、三棱活血行氣、通絡止痛，共為臣藥；肉桂散經絡中之寒濕為佐藥，甘草為使，調和諸藥，共奏祛風散寒、除濕通絡、活血止痛之功。此方所治主證可針對臨床常見的風寒夾濕兼瘀血阻絡型的RA。實驗結果驗證風濕寧五號方組方的合理性和科學性，同時證實我們發(fā)現(xiàn)治療RA用藥規(guī)律的正確性，這些與治療RA的中醫(yī)病因病機學的理論高度吻合。

［1］俞煒.中藥復方拆方研究存在問題的探討［J］.海峽藥學，2011，23（1）：162-163.

［2］陸紅，張信岳，劉芳芳，等.舒膽通顆粒利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛作用的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2010，17（4）：300-303.

［3］代先坤，羅福玲，章卓，等.粉防己堿對脂多糖致小鼠的痛覺增敏的影響及機制［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（5）：1 049-1 050.

［4］ALison Bendele，Tracy Mcabee，Gina Sennello.Efficacy of sustained blood level of interlenkine-1 receptor antagonist in animal models of arthritis：Comparison of efficacy in animal models with human clinical data［J］.Arthritis&Rhermatism，1999，42（3）：498-506.

［5］徐榮芳，薛慧清，閆潤紅，等.黃芪藥材的發(fā)酵研究進展［J］.山西中醫(yī)學院學報，2012，13（3）：140-142.

［6］李艷彥，王永輝，張永剛，等.黃芪桂枝五物湯不同給藥途徑對凍傷模型大鼠的影響及其作用機制［J］.中西醫(yī)結合學報，2010，8（2）：181-186.

［7］李曉云.三藤通痹丸治療類風濕性關節(jié)炎的臨床研究［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學，2008.