許凱霞，王永輝，楊向竹，馮前進(jìn)

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原030024； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

目前，對健康和疾病發(fā)育起源（DoHaD）的研究正成為全球范圍內(nèi)的重大挑戰(zhàn)之一［1］。大量臨床流行病學(xué)研究及動物實(shí)驗(yàn)證明胎兒在宮內(nèi)發(fā)育時受到遺傳因素和宮內(nèi)環(huán)境的影響，不僅會影響胎兒期的生長發(fā)育，并可能產(chǎn)生持續(xù)的結(jié)構(gòu)功能改變，導(dǎo)致將來一系列成年期疾病的發(fā)生［2-5］。其中，胎兒對多種宮內(nèi)不良環(huán)境的一個常見反應(yīng)是引起胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR）。

胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR），是指胎兒出生體重低于同胎齡平均體重的第十個百分位或兩個標(biāo)準(zhǔn)差，與成年期糖尿病、高血壓等多種慢性重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］，類似于中醫(yī)的“胎萎不長”。祖國的傳統(tǒng)中醫(yī)藥本著“腎為先天之本，腎主生殖發(fā)育”和“補(bǔ)母益子”的理論，有著治療“胎萎不長”的豐富經(jīng)驗(yàn)。本研究結(jié)合目前國內(nèi)外圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)、計(jì)劃生育科學(xué)及對健康和疾病發(fā)展起源的研究十分關(guān)注的慢性非傳染性成人疾病的“胎兒起源”學(xué)說，選用酒精給妊娠小鼠灌胃致IUGR模型，選擇動物體內(nèi)能量代謝必不可少的肌酸激酶（CK）為觀察指標(biāo)，采用古今治療腎虛的補(bǔ)腎名方給孕鼠灌胃，同時與補(bǔ)氣、補(bǔ)血等方做比較，以探討補(bǔ)腎方對胚胎能量代謝的影響，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度為中醫(yī)的“腎為先天之本，腎主生殖發(fā)育”和“補(bǔ)母益子”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 遠(yuǎn)交系昆明種小鼠，體重（28±2）g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK（京）0089326，2004-0001。

1.1.2 藥物與試劑 左歸丸（熟地∶山藥∶山萸肉∶枸杞子∶菟絲子∶鹿角膠∶龜板膠∶川牛膝=8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3），右歸丸（熟地∶山藥∶山萸肉∶枸杞子∶菟絲子∶鹿角膠∶杜仲∶當(dāng)歸∶肉桂∶制附子=8∶4∶3∶4∶4∶4∶4∶3∶2∶2），五子衍宗丸（枸杞子∶炒菟絲子∶覆盆子∶鹽炒車前子∶蒸五味子=8∶8∶4∶2∶1），四君子湯（黨參∶炒白術(shù)∶茯苓∶炙甘草=2∶2∶2∶1）。原藥材均來自山西省中醫(yī)藥研究院草藥房，每方質(zhì)量濃度均為生藥量1 g/mL。藥物的煎制和濃縮均用陶瓷制品手工操作。分析純乙醇（廣州化學(xué)試劑二廠，批號：2007061201）加蒸餾水配制成40%（V/V）的乙醇溶液，臨用現(xiàn)配。肌酸，三羥甲基氨基甲烷，ATP，半胱氨酸，三氯醋酸，氨基萘酚磺酸，磷標(biāo)準(zhǔn)溶液等。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 BECKMAN低溫高速離心機(jī)，島津UV-3000紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 小鼠雌雄比例2∶1合籠過夜，次日晨檢見陰栓者或陰道涂片鏡檢見精子者，確定為受孕，當(dāng)日記為受孕0 d，將孕鼠隨機(jī)分為正常對照組、IUGR模型組、左歸丸組、右歸丸組、五子衍宗丸組、四君子湯組、四物湯組、八珍湯組，共8組。

1.2.2 模型制備與給藥方法 除正常對照組外，其余各組于受孕8 d用酒精灌胃，12 mL/kg，1次/d，至19 d殺檢，共11 d。各治療組在8 d造模同時，分別予左歸丸、右歸丸、五子衍宗丸、四君子湯、四物湯、八珍湯灌胃，30 mL/kg；IUGR模型組和正常對照組予生理鹽水灌胃，30 mL/kg，1次/d。

1.2.3 樣品制備與指標(biāo)檢測 19 d剖取胎仔，將胎仔左前肢肌肉除下，用0.25 M蔗糖溶液清洗，加3 mL蔗糖行組織勻漿（冰?。?，靜置提取1 h，離心抽提（3 000 rpm，15 min），保留上清液，沉淀加 2 mL蔗糖溶液，混勻2 min，靜置提取1 h，再離心抽提（3 000 rpm，15 min），將2次的離心抽提液混合待測。由于CK 受許多金屬離子如 Zn2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+的抑制，還有檸檬酸、氟化物、尿素、過量ATP、EDTA等的抑制，所以在試劑配制過程及測定過程中極注意清潔、高純，以免使CK失活。測定方法用無機(jī)磷酸法［8］，利用CK催化肌酸和ATP生產(chǎn)磷酸肌酸，與鉬酸銨生成磷鉬酸銨，后受氨基萘磺酸還原而成藍(lán)色復(fù)合物。用島津UV-3000紫外可見光分光光度計(jì)1 cm比色杯，650 nm處比色，查磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得單位數(shù)。磷標(biāo)準(zhǔn)曲線是將不同濃度磷溶液代替所測酶溶液，其過程相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)包對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以（s）表示，多組間采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

補(bǔ)腎及補(bǔ)益氣血方劑對胎鼠骨骼肌肌酸激酶（CK）活性的影響，結(jié)果見表1。

表1 補(bǔ)腎及補(bǔ)益氣血方劑對胎鼠CK活性的影響 （s）

表1 補(bǔ)腎及補(bǔ)益氣血方劑對胎鼠CK活性的影響 （s）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

組別 給藥劑量（mL/kg）n CK活性（U/mg）正常對照組 - 5 8.90±0.652）IUGR模型組 - 4 7.55±0.34五子衍宗丸組 30 5 7.49±0.92左歸丸組 30 6 8.70±0.562）右歸丸組 30 5 8.37±0.461）四物湯組 30 3 7.80±1.63四君子湯組 30 4 7.72±0.89八珍湯組 30 4 8.67±0.541）

從表1可看出，IUGR模型組胎鼠骨骼肌CK活性比正常對照組明顯降低，補(bǔ)腎陰左歸丸、補(bǔ)腎陽右歸丸及氣血雙補(bǔ)八珍湯方劑對胎鼠降低的骨骼肌CK活性有明顯恢復(fù)作用，尤以補(bǔ)腎陰方劑左歸丸作用最明顯。平補(bǔ)腎方五子衍宗丸和單純的補(bǔ)氣四君子湯、補(bǔ)血四物湯則無此作用。

3 討論

能量是維持生物體新陳代謝、生長、發(fā)育的源泉，從糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等至生物體的每一器官的運(yùn)動，能量的儲存與釋放過程無處不在。那么，能量代謝如何在中醫(yī)治則中體現(xiàn)呢？

3.1 胎兒代謝及運(yùn)動的能量來源

能量供給在胎兒發(fā)育過程中是必不可少的，它負(fù)擔(dān)著胎兒肌肉收縮等運(yùn)動。而能量的最終來源究竟為何物？眾所周知，從低等的單細(xì)胞生物到高等生物及人類，胎兒代謝及運(yùn)動的能量的釋放、儲存和利用都是直接以ATP為線進(jìn)行的。然而機(jī)體產(chǎn)生的ATP，并不是隨時被利用，而是以一種特殊物質(zhì)方式儲存起來，當(dāng)機(jī)體需要大量能量時，ATP便又被釋放出來，磷酸肌酸（CP）就是這種儲能的物質(zhì)。肌肉收縮所需能量來自ATP的分解，但酵解抑制后，刺激肌肉收縮持續(xù)的時間為肌肉內(nèi)ATP功能所維持的5倍，可見除ATP外還有其他高能物質(zhì)提供能量，CP就是這種高能化合物。CP在肌肉中的濃度比ATP高5倍，在CK作用下可迅速將所含高能磷酸鍵轉(zhuǎn)到ADP分子形成ATP，參與胎兒肌肉運(yùn)動。

3.2 胎兒肌肉運(yùn)動的能量與中醫(yī)理論的聯(lián)系

中醫(yī)理論認(rèn)為：腎藏精，主生殖和發(fā)育，其所藏之精包括先天之精和后天之精。其中，先天之精受之于父母，是胚胎形成的原始物質(zhì)，對人體進(jìn)一步生長發(fā)育及繁殖后代的能力有促進(jìn)作用；后天之精是出生后，從吸入的自然界清氣及攝入的飲食物中攝取的營養(yǎng)精華成分以及臟腑氣化所生成的精微物質(zhì)。腎精的構(gòu)成，是以先天之精為基礎(chǔ)，加之部分后天之精的充養(yǎng)而成。先天之精是腎精的主體成分，后天之精僅起充養(yǎng)作用，因而腎精所化的腎氣，也主要屬先天之氣，即元?dú)?，元?dú)馐蔷S持人體生命活動的基本物質(zhì)與原動力，主要功能是推動人體的生長和發(fā)育，溫煦和激發(fā)臟腑、經(jīng)絡(luò)等組織、器官的生理功能。又，精血可互生即“精血同源”。所以氣血之源來源于腎，同時氣、血、精又有相輔相成的作用。血之所以能循行脈中，周流不息，與氣的功能極為密切，氣行則血行，氣滯則血滯，“氣為血之帥”，“血為氣之母”，氣血亦可互生。

本研究顯示，孕鼠投以補(bǔ)腎陽方右歸丸、補(bǔ)腎陰方左歸丸，對胎鼠骨骼肌CK活性均產(chǎn)生了明顯增高作用，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度為中醫(yī)“腎為先天之本，腎主生殖發(fā)育”和“補(bǔ)母益子”理論在能量代謝方面提供了依據(jù)。氣血雙補(bǔ)方劑八珍湯亦可增高胎鼠骨骼肌CK活性，可能是由于通過氣血雙補(bǔ)先充實(shí)了母體的后天之精，進(jìn)而間接補(bǔ)充了胎鼠的先天之精。中醫(yī)氣血循環(huán)體系與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)人體全身代謝有極為相似之處。從受精卵、胚胎發(fā)育、幼兒期、少兒期、成人期至衰老死亡，人類體內(nèi)代謝及遺傳一直處于閉合循環(huán)體系中，三大營養(yǎng)物質(zhì)糖類、脂類、蛋白質(zhì)的生物合成與代謝及遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯都遵循循環(huán)體系，而許許多多更小的循環(huán)體系如TAC環(huán)、氮循環(huán)、鳥苷酸循環(huán)等又貫穿于人體大代謝中。中醫(yī)補(bǔ)腎、氣血雙補(bǔ)方劑作用于人體代謝的循環(huán)中，對肌肉能量代謝的影響可能作用于兩個方面，一是作用于整個能量代謝的過程，即從葡萄糖進(jìn)入己糖激酶轉(zhuǎn)化為6-PGLasose開始的每一步驟，中醫(yī)方劑都參與其調(diào)控機(jī)能。二是直接作用于靶位點(diǎn)，即能量調(diào)節(jié)中心點(diǎn)，就是直接參與肌肉能量代謝關(guān)鍵酶CK、ATP 酶等的合成與激活作用［8］。

總之，中醫(yī)方劑對人體的影響是一個比較復(fù)雜的過程，需經(jīng)過許多現(xiàn)代科學(xué)，如分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、基因工程等多學(xué)科研究、證實(shí)才能有一個確切結(jié)論。而我們只是通過一些分子酶學(xué)的研究，對中醫(yī)理論有些新的認(rèn)識，提出一些新的假設(shè)，還需不斷深入研究討論。

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