王晶晶， 紀會會， 焦 山

（合肥師范學院 生命科學系，安徽 合肥230601）

1 引言

動物線粒體DNA呈共價閉環(huán)雙鏈結構，在一級結構上，其進化速率為核DNA的5～10倍，絕大多數都表現為母系遺傳。其基因組結構相對穩(wěn)定、簡單、無組織特異性、便于分析，而且容易純化得到，使其成為研究動物起源進化及群體遺傳分析的理想的研究對象［1－2］。堿基序列分析雖然技術要求高，花費大，但通過測定線粒體DNA全序列或部分基因片段序列可以了解堿基的置換、缺失、插入等實際情況，并可比較不同物種或個體堿基相關序列的差異，從而探討進化關系，因此比其他分析方法具有很大的優(yōu)點，目前已被應用到分類進化領域研究中［3－4］。

M.和S.Nass發(fā)現線粒體DNA（mtDNA）后，又發(fā)現線粒體DNA還能合成12S和16SrRNA及22種tRNA，隨著分子系統(tǒng)學以及DNA分子技術的發(fā)展，從DNA水平研究物種間親緣關系以及進行物種輔助鑒定已經逐漸成為一種新的手段［3－6］。已知動物線粒體DNA（mtDNA）具有分子量小、母性遺傳以及比核基因DNA進化速度快等特點，其中的12S和16SrRNA片段更是保守，所以Hedges and Maxsom （1993）和 Hay et al.（1995）便提出了線粒體12S和16SrRNA基因可以用于研究兩棲動物系統(tǒng)發(fā)育［7］，不少學者做了大量的工作?，F已被廣泛應用于種內和種間系統(tǒng)發(fā)育研究中，尤其在蛙科的系統(tǒng)發(fā)育方面［7－8］。

兩棲動物是從水生到陸生進化上的一個關鍵環(huán)節(jié)，在系統(tǒng)進化上具有承前啟后的重要作用［9］。兩棲類是脊椎動物進化從水生到陸生重大轉變過程中的一個過渡類群，在地球生命進化研究中占有重要地位。花臭蛙（Rana schmackeri）隸屬兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蛙科（Ranidae），鼓膜大，約為第三指吸盤的2倍［10］；上眼瞼、體后背部及后肢背面均無小白刺，體側無背側褶；指、趾具吸盤，縱徑大于橫徑，均有腹側溝；體背面為綠色，間以棕褐色或褐黑色大斑點，多近圓形并鑲以淺色邊［9－10］；分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、陜西、甘肅等地，多見于較開闊的山溪及附近潮濕處以及常蹲在有苔蘚的巖石上，其生存的海拔范圍為200至1500米，是中國的特有物種［10］。

在具有獨特進化地位的兩棲類動物中，對系統(tǒng)進化上的保守性狀進行深入研究，將有助于花臭蛙的系統(tǒng)分化與分類問題提供依據［11－13］。本實驗是通過測定花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因序列，再利用ClustalX軟件分析與其他相關物種（例如：黑斑蚊、花臭蛙、天臺蛙）的同源關系，為將來花臭蛙的分類提供分子生物學方面的證據。

2 材料和方法

2.1 材料

實驗所用的花臭蛙于2011年6月采自安徽黃山自然保護區(qū)海拔500米附近的山溪，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗主要試劑：購買自TIANGEN的TIANa－mp Genomic DNA Kit、Ex Taq 酶、dNTPs、1000bpLadder、10×Ex Taq緩沖液。

2.2 方法

2.2.1 基因組DNA的提取

取0.1g花臭蛙肌肉組織，利用TIANGEN公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取其基因組DNA。將乙醇沉淀后DNA溶解于50μL滅菌蒸餾水，測定DNA濃度后于4℃存放。為防止DNA污染，在基因組DNA提取過程中，以陰性作為對照，用TE溶液代替溶解樣品。為避免交替污染，DNA提取分3次在不同的時間進行。

2.2.2 引物設計及PCR擴增

根據從GenBank檢索到的其它相關蛙科物種的12S和16SrRNA基因序列，分別設計花臭蛙12S和16SrRNA基因引物：

12SrRNA——F 5′－GAACTACGAGCC－3′，12SrRNA——R 5′－GTGTACGCGTCC－3′；

16SrRNA—F 5′－UGAGCAUAGUUG — 3′，16SrRNA—R 5′－AUAGGAUCAC－3′。在PCR儀（Backman）上進行PCR擴增。PCR反應總體積為25μL，包括：濃度20～50μmol／μL引物各1μL，10×Ex Taq 緩沖液（TIANGEN）2.5μL，dNTPs（TIANGEN）2μL，1Lg模板 DNA 1μL，Ex Taq 酶（TIANGEN）1.25U，其它為滅菌蒸餾水。PCR反應程序如下：12SrRNA（94℃預變性300s，然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)，最后72℃延伸420s）；16SrRNA（95℃預變性5min，95℃變性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)次數為30。循環(huán)結束后再72℃延伸10min）。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增片段大小，溴化乙錠染色，紫外透射儀觀察并照相記錄。

2.2.3 序列測定

觀察到條帶后將樣品送至上海生工進行花臭蛙12S和16SrRNA基因片段的序列測定。

2.2.4 數據分析

利用DNASTAR軟件對測得的12S和16S rRNA基因序列進行編輯排序和計算，再利用ClustalX軟件分析其與黑斑蛙（Rana nigromaculata，GenBank登陸號：JN541318.1）、天臺蛙（Rana tientaiensis，GenBank登陸號：AF205560.1）、大壁虎（Gekko gecko，GenBank登陸號：DQ093192）、卡氏小鼠 （Mus caroli，GenBank 登陸號：JQ287760.1）、大猩猩（Gorilla gorilla，GenBank登陸號：AJ627520.1）以及人（Homo sapiens，Gen－Bank登陸號：AF121220.1）的同源關系。

3 結果與分析

3.1 花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因片段的PCR擴增

利用GenBank檢索到的其它相關蛙科物種的12S與16SrRNA基因序列設計的簡并引物進行花臭蛙線粒體基因12S和16SrRNA片段的PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠進行電泳分離，可見清晰的特異性擴增條帶，長度與預期一致，而且空白對照試驗未出現擴增產物。（圖1是擴增結果）

圖1 花臭蛙線粒體12S與16SrRNA基因片段PCR擴增結果

3.2 花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因片段序列的測定

測定出花臭蛙（Rana schmackeri）線粒體基因12SrRNA 347bp的基因片段（如下圖2），其中A、T、G 、C 的含量分別是 105bp（30.26%），78bp（22.48%），76bp（21.90%），88bp（25.36%）。A＋T含量為52.74%，C＋G含量為47.26%。

圖2 檢測得到的花臭蛙的線粒體12SrRNA基因序列

花臭蛙16SrRNA序列長度為380bp（如下圖3），對測序結果統(tǒng)計4種堿基（A、G、C、T）在核苷酸序列中的平均含量，發(fā)現A、G、C、T含量分別為：31.8% （121 個）、20.8% （79 個）、25.8% （98個）、21.6%（82個）；其中 G＋C為47%，A＋T為53%。

圖3 檢測得到的花臭蛙的線粒體16SrRNA基因序列

3.3 線粒體12S和16SrRNA基因序列堿基組成的比較

根據現有的研究，通過測定動物的線粒體基因全序列或者部分序列，再相比較物種或個體堿基序列差異可以研究探進化關系。在GenBank中下載了大綠蛙（Rana livida）、黑斑蛙（Rana nigromaculata）、天 臺 蛙 （Rana tientaiensis）、林 蛙 （Rana chensinensis）及大蹼林蟾（Bombina maxima）的線粒體12S和16SrRNA同源序列進行進行分析比對（見表1、表2）。

表1 四種蛙的12SrRNA基因序列的堿基構成情況

表2 四種兩棲類物種16SrRNA基因片段堿基組成

在表1中，大綠蛙、黑斑蛙和天臺蛙的序列長度分別為347bp、350bp、386bp，其 A、T、C、G 的含量分 別 為 29.11%、23.34%、25.36%、22.19%；31.31%、22.98%、26.52%、19.19%；30.57%、21.50%、27.46%、20.47%。經試驗測定得到的花臭蛙347bp的序列中 A、T、C、G的含量分別為30.26%、22.48%、25.36%、21.90%。與上面三種蛙的線粒體12SrRNA序列對比之后不難發(fā)現，花臭蛙、大綠蛙、黑斑蛙和天臺蛙四種種蛙中A＋T的含量平均值十分相近，在52.07%～54.29%之間，略高于C＋G的含量（47.26%～47.93%）。

同理，將花臭蛙16SrRNA的序列與大綠蛙、林蛙及大蹼鈴蟾的序列進行分析（見表2），經計算各個堿基在相應的基因片段所占比例相似，且A＋T的含量也都大于G＋C的含量。直接反映出了以上四個物種具有較高同源性，也表明16SrRNA在蛙科進化中的保守性。

3.4 花臭蛙與其它物種的同源性比較

利用ClustalX軟件，從GENBANK下載一些物種的相關序列，分別對花臭蛙的12S和16S進行序列的同源性分析（見表3、表4），可得到花臭蛙線粒體12SrRNA與天臺蛙的相關序列同源性為80.45%，與魚類中的黯紋東方鲀相關序列的同源性63.25%，與爬行類四線棉蛇的相關序列的部分片段同源性為65.43%，與哺乳類家鼠相關基因的同源性為66.34%。

表3 花臭蛙與其他物種12SrRNA基因的同源性比較

花臭蛙16SrRNA基因與同為兩棲類蛙屬的天臺蛙（Rana tientaiensis）同源性高達86%，與爬行類的大壁虎（Gekko gecko）同源性為74%，與四線棉蛇（Elope quatuorlineata）的同源性為78%，與魚類的斑馬魚（Danio rerio）同源性為68%，與哺乳類家鼠的同源性為65%。

表4 花臭蛙與其他物種16SrRNA基因的同源性比較

4 討論

4.1 用線粒體基因研究的意義

線粒體基因能夠獨立地進行復制和轉錄，且分子量小，結構較簡單，使得其更容易從組織中分離、提純；線粒體基因mtDNA因其母系遺傳、無內含子、缺少重組的遺傳物質，而常被用于物種的系統(tǒng)進化和分類地位的研究［13－14］。其中，16SrRNA 基因進化程度適中，通過堿基序列分析，再與其它相關物種進行同源性分析，比較差異，來探討進化關系，其常作為分子標記用于哺乳動物、鳥、兩棲、爬行類等物種系統(tǒng)進化的研究［15］。

4.2 花臭蛙與其它物種12S和16SrRNA的同源性分析

利用ClustalX軟件將花臭蛙與相關物種的目的片段進行同源性分析，結果顯示：花臭蛙與天臺蛙的同源性最高，達到了（12SrRNA達到80.45%，16SrRNA達到86%），而與爬行類的四線棉蛇等相關物種具有較高的同源性（12SrRNA達到65.43%，16SrRNA達到65%），與哺乳類的家鼠、魚類的斑馬魚具有一定的同源性（與家鼠的12S rRNA達到66.34%，16SrRNA達到65%），這與兩棲類內部親緣關系較近，兩棲類與其它相關物種的親緣關系較遠相符合，符合物種的進化規(guī)律，下一步可通過構建系統(tǒng)進化樹來研究花臭蛙在蛙科分類中的關系和地位［16－18］。

4.3 展望

隨著DNA的序列分析、PCR技術的應用，mtDNA在動物起源、種群分化等方面已經取得了具有應用價值的成果。mtDNA的堿基序列分析雖然是個浩大的工程，不僅花費很高，技術要求也很高，但mtDNA進化速度適中，基因高度保守，通過測定物種個體mtDNA的堿基序列，然后與其它相關物種的堿基序列進行同源性分析，比較差異，來探討物種的進化地位，這相對于其它分析方法，具有很大的優(yōu)勢［1－4］。

目前在我國，兩棲動物的生存現狀不容樂觀，部分甚至有瀕臨滅絕的危險。我們可通過分子生物學方面的手段來研究動物線粒體基因，了解物種的生物學特性，從而制定出相應的保護措施，緩解物種的滅絕趨勢［8－11］。

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